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PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT Catalog Number: BC-1301
pd-1酶免疫測定試劑盒 目錄編號:bc-1301
酶免疫法定量測定人血清和血漿中Pd-1濃度
只作研究用途
不適用于診斷程序
介紹
程序性細胞死亡蛋白1(pd-1,CD 279,pdd 1)是一種細胞表面受體,是調(diào)節(jié)T細胞炎癥活動和維持免疫外周耐受的關鍵。 系統(tǒng)(1)。pd-1可以與配體pd-l1和pd-l2t相互作用。pd-1具有胞外IGV結(jié)構域、跨膜結(jié)構域和胞內(nèi)尾部兩個磷酸化位點(shp-1和shp-2)。 o下調(diào)免疫系統(tǒng),抑制T細胞活性(2)??乖R別后,活化的T細胞在其表面表達pd-1,產(chǎn)生干擾素,誘導pd的表達。 -L1,從而促進細胞凋亡或細胞死亡。(3)當被腫瘤細胞劫持時,pd-1配體的異常表達抑制免疫調(diào)節(jié)的T細胞活化,導致疾病進展。 (表示方向)向 (4).
血清和血漿中Pd-1水平升高與類風濕關節(jié)炎和皮膚硬化有關(5,6)。Pd-1主要由腫瘤浸潤的T細胞(7)表達.進一步區(qū)域 研究表明,使用針對pd-1免疫檢查點的單克隆抗體有助于在理解和治療黑色素瘤和其他vario等癌癥方面取得突破性進展。 美國非小細胞肺癌(4)。
測定原理
pd-1酶聯(lián)免疫吸附試驗是以固相酶聯(lián)免疫吸附試驗為基礎的.該檢測系統(tǒng)使用了針對不同抗原決定的*的單克隆抗體對。 pd-1分子上的NT。用一種小鼠抗PD-1單克隆抗體進行固相固定(在微滴度井上).另一種與辣根堿結(jié)合的單克隆抗pd-1抗體 過氧化物酶(HRP)存在于酶的共軛溶液中。測試樣本被允許與這兩種抗體依次反應,導致pd-1分子被夾在固體ph之間。 ASE和酶解抗體。在室溫下進行兩次單獨的60分鐘孵育后,用洗滌緩沖液沖洗水井,除去未結(jié)合的標記抗體。添加了TMB試劑 D在黑暗條件下孵育20分鐘,形成藍色。隨著停止解決方案的添加,顏色開發(fā)停止,將顏色更改為黃色。c Pd-1的濃度與樣品的顏色強度成正比.在450 nm處分光度法測定吸光度。
提供的試劑和材料
抗體包被井(1板,96井)微滴度井,用小鼠單克隆抗pd-1包被。
含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-BSA溶液中50 ng/ml Pd-1標準品(0.5 mL/小瓶)
標準稀釋劑和樣品稀釋劑(30 mL/瓶,1瓶)含有含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-bsa溶液。
酶結(jié)合試劑(12 mL/小瓶,1小瓶)含有與辣根過氧化物酶結(jié)合的小鼠單克隆抗pd-1。
20倍洗滌劑磷酸鹽緩沖液(50 mL/瓶,1瓶)
TMB試劑(11 mL/瓶,1瓶)含有一步TMB溶液。
停液(11 mL/瓶,1瓶)含有稀釋鹽酸(1NHCl)
貯藏條件
將未打開的工具包保存在2-8°C,收到后,當它沒有使用,直到到期顯示在工具包標簽上。有關過期日期,請參閱包標簽。
將微滴度板放在一個裝有干燥劑的密封袋中,以盡量減少對潮濕空氣的暴露。
試劑準備
1.所有試劑在使用前應允許達到室溫(18-25°C)。
2.對于每次測試運行,準備一個新的標準集。
3.用標準/樣品稀釋劑稀釋50~10 ng/mL。用標準/樣品稀釋劑制備10 ng/mL標準的雙倍系列稀釋劑:
a.10納克/毫升:0.12毫升50納克/毫升0.48毫升標準品/樣品稀釋劑
b.5納克/毫升:0.25毫升10納克/毫升標準品/樣品稀釋劑
c.2.5納克/毫升:0.25毫升5納克/毫升標準品/樣品稀釋劑
1.25ng/mL:0.25毫升2.5納克/毫升標準品/樣品稀釋劑
e.0.625 ng/mL:1.25ng/mL標準品/樣品稀釋劑0.25mL
f.0.313 ng/mL:0.25mL/0.625 ng/mL標準品/樣品稀釋劑2
標準稀釋劑0.156 ng/mL:0.313 ng/mL 0.25mL
i.0 ng/mL:0.25 mL標準稀釋劑
5.病人樣本在使用前需要稀釋4倍。制備一系列小管(即1.5 mL微離心管),將60L血清與180 L標準/樣品稀釋劑混合。
6.工作洗滌緩沖器:從20倍庫存中制備1倍洗滌緩沖液。加入50毫升的20倍洗滌緩沖液庫存到950毫升的直接水。工作洗滌緩沖液在2~8°C溫度下穩(wěn)定運行30天.注:任何晶體 這可能是由于高鹽濃度的存在,必須在室溫下再溶解,然后再進行稀釋。
檢測程序
準備標準。見試劑準備。
稀釋樣品1:4稀釋。見試劑準備。
確保所需數(shù)量的涂層井在保持架。
配發(fā)Pd-1標準的100mL,并將樣品稀釋到適當?shù)木?
室溫(18-25°C)孵育60 min.
將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中,將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水紙或紙上 r毛巾去除所有殘留水滴。
將Pd-1工作酶結(jié)合劑的100mL配伍到每口井中.
室溫(18-25°C)孵育60 min.
將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中,將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水紙或紙上 r毛巾去除所有殘留水滴。
在每口井中分配100mL TMB溶液。
室溫(18-25°C)孵育20分鐘.
通過在每口井中加入100mL的停止溶液來停止反應。
輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍色*變成黃色。
14.在450 nm處讀取吸光度,15分鐘內(nèi)使用微滴度良好的閱讀器。
統(tǒng)計
計算每組參考標準、對照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。
通過繪制每個參考標準的平均吸光度(以納克/毫升為單位)繪制在圖表紙上,并在垂直(Y)軸和濃度上繪制一條標準曲線。 在水平(X)軸上。
用每個樣品的平均吸光度值,從標準曲線上測定相應的Pd-1濃度(ng/mL)。視經(jīng)驗和/或計算機可用情況而定 可以使用其他的數(shù)據(jù)縮減方法。
樣品的檢出值應乘以稀釋倍數(shù)為4,得到Pd-1的結(jié)果為ng/ml。
標準曲線實例
一個典型的標準運行結(jié)果,吸光度讀數(shù)在450 nm處顯示在Y軸上,而pd-1濃度顯示在X軸上。注:這條標準曲線是為了說明 僅用于計算未知數(shù),不應用于計算未知數(shù)。每個實驗室必須在每個實驗中生成自己的數(shù)據(jù)和標準曲線。
工作特性
敏感,感受性
用2SD法測定的Pd-1酶聯(lián)免疫吸附試驗的低檢出濃度為0.15ng/ml。
度,準確(性)
b.在一系列單獨校準的測試中,通過對三個不同樣本的重復測量,確定了運行間精密度。批間變異顯示b。 below在下面,到下面
1.回收率和線性研究。回收樣品加入已知的Pd-1水平,并一式兩份進行測定。平均回收率為105.3%。
b. 對三個樣品進行連續(xù)稀釋,以確定線性度。平均回收率為99.6%。
參考
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