用于樹突和樹突棘浸染的GOLGT-COX染色系統(tǒng)
于體外研究
Bioenno Golgi Kit是一種基于高爾基染色法設(shè)計(jì)出來的試劑盒,用于浸染神經(jīng)元樹突和樹突棘(參見下面的參考文獻(xiàn))。該試劑盒在大鼠、小鼠、貓、兔和猴子以及人類死亡后所獲得的新鮮腦組織上進(jìn)行了廣泛多次的測(cè)試,確定了該試劑盒能將樹突和樹突棘穩(wěn)定和高質(zhì)量的染色(見圖A-C)。大多數(shù)神經(jīng)元根據(jù)其組織年齡大小,用該試劑盒浸漬需要7-14天(見表2)。試劑盒儲(chǔ)存在室溫(4-25ºC)下的黑暗區(qū)域。
圖中為用Bioenno Golgi Kit侵染的樹突分支和樹突棘
(A):低倍率(4×物鏡)顯微鏡照,顯示海馬體中高爾基體浸漬的神經(jīng)元。
(B):從尾狀后肌取出的紋狀體神經(jīng)元。左側(cè)面板框架區(qū)域中的樹突棘(20×),在右側(cè)圖片中放大顯示(箭頭,63×)。
(C):從皮質(zhì)采取的錐體神經(jīng)元。 中間面板框架區(qū)中樹突分支上的樹突棘(20×)被放大顯示在 斜(左,100×)和 主(右,100×)中。 這個(gè)階段常觀察到類似絲狀偽足的突起(左側(cè)圖片的箭頭)。
參考文獻(xiàn):
• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.
• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.
• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.
• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.
保質(zhì)期:套件中的物品保質(zhì)期為自購(gòu)買之日起的12個(gè)月之內(nèi)。
退貨政策:Bioenno Tech對(duì)此產(chǎn)品的退貨政策是自購(gòu)買之日起90天之內(nèi)。
免費(fèi)技術(shù)支持:
隨套件提供的材料:
•溶液A:浸漬溶液(240 ml×2瓶)。溶液A是工作液,在底部看到沉淀物是正?,F(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)只需使用其上清液。
•試劑B:用于制備兩種工作緩沖液。
緩沖液1:浸漬后緩沖液(30 g×5 瓶)制備方法:在90 ml dH2O中稀釋 30g 試劑B
緩沖液2:收集和安裝緩沖液(30 g×5 瓶)制備方法:在500 ml dH2O中稀釋30 g試劑B
工作緩沖液可在4ºC下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)4周。
•溶液C:染色溶液(220 ml×2 瓶)。所提供的溶液C需在使用前用dH2O(體積比為3:5)稀釋。
例如,18ml溶液C + 30ml dH2O→48ml工作液,試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。 48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,在所提供的染色罐中總共有10個(gè)載玻片,每個(gè)載玻片黏附有12個(gè)鼠腦切片)。
•試劑D:復(fù)染緩沖液(90 g×2 瓶)。使用前需用dH2O稀釋試劑。
在500 ml dH2O中稀釋90 g試劑D形成工作液。工作液可在室溫下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。
48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,如上所述在染色罐中的12個(gè)切片×10個(gè)載玻片)。
•還包含:
著色筆(大,扁平,1 只),用于切片轉(zhuǎn)移;
圓頭筆(小,1 個(gè)),用于切片安裝;
帶蓋的染色罐(2個(gè)),用于存儲(chǔ),染色和清洗粘連在粘性顯微鏡載玻片上的切片。
套件不提供的必要材料:
蒸餾水或去離子水(dH2O);
0.01M PBS-T(見表1);
塑料或玻璃管和瓶子;
塑料鉗;
組織學(xué)用品和設(shè)備:粘合劑,顯微鏡載玻片,蓋玻片,光學(xué)顯微鏡,震動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī),乙醇,二甲苯或二甲苯替代品,Permount®封片劑。
0.01 M PBS-T, pH 7.4 |
1000ml |
NaCl
0.1 M PB (pH 7.4)
Triton X-100
加入 dH2O 至
加熱攪拌至50~55℃,以增強(qiáng) Triton X-100的溶解 | 8.5g
100ml
3ml
1000ml |
表1:制備0.01M PBS-T,需先配制0.1M PB(左),然后配制含有0.3%Triton X-100的PBS(右)。
0.1M PB, PH7.4 |
1000ml |
NaH2PO4 •dH2O
NaH2PO4 •7dH2O
加入 dH2O 至
(攪拌使其溶解) | 2.62g
21.73g
1000ml |
存儲(chǔ)、安全和處理注意事項(xiàng):
·•將試劑盒存放在室溫下。
·•試劑盒中的溶液A和C為含劇毒試劑。 需在通風(fēng)櫥中準(zhǔn)備并使用,使用完后收集所有廢物。
• 套件A中含有用于危險(xiǎn)廢物處理的瓶子。
·•在處理試劑盒試劑時(shí),需戴上手套,眼睛和面部有適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)以及穿戴合適的防護(hù)服,處理后需*清洗雙手。
·•處理時(shí)避免試劑的吸入和接觸皮膚,眼睛。 如接觸,立即用水*清洗,必要時(shí)尋求醫(yī)療援助。
建議:
·•在處理溶液A和C時(shí)使用帶蓋的玻璃或塑料容器。
·•始終保持容器密閉。不要使用金屬工具來承裝溶液A。
·•使用溶液A,C或D處理大腦或切片時(shí),避免大腦或切片受光照影響。
·•不要重復(fù)使用或稀釋工作液,在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以獲得宜效果。
1.浸漬:將剛收獲的腦組織浸入溶液A中。溶液A的體積大約是組織塊體積的10倍。 例如, 20ml溶液A對(duì)應(yīng)成年大鼠腦(1cm×1cm×2cm)體積。
浸泡1~2天后更換溶液,并在室溫下繼續(xù)避光浸漬(建議浸漬天數(shù)見表2)。
意見建議:為了獲得宜侵染,建議用生理鹽水灌注動(dòng)物,清除組織中的血液。 麻醉動(dòng)物(例如用戊巴匕匕妥鈉,腹膜內(nèi)注射100mg / kg)。心臟內(nèi)或升主動(dòng)脈用0.9%生理鹽水(例如 1000ml dH2O中含有9g NaCl)灌注至內(nèi)臟血液量被沖洗掉。灌注通常需要3~5分鐘。 解剖大腦并將其謹(jǐn)慎地從頭骨上移除。用鋒利的刀片切割大腦至1厘米左右的厚度,在0.9%鹽水中短暫沖洗,然后浸入溶液A.
表2:20-22℃下建議的浸漬總天數(shù)(P:出生后一天; 如:P2表示“2天齡”)
動(dòng)物年齡 | 尺寸 | 浸漬時(shí)間 |
P2大鼠 | 全腦包括頭骨無灌注 | 無灌注,9天 |
P6大鼠 | 半球 | 鹽水灌注,7天 |
P*鼠 | 半球 | 鹽水灌注,9天 |
P24大鼠 | 半球 | 鹽水灌注,10天 |
P24大鼠 | 海馬塊包括皮質(zhì) | 鹽水灌注,10天 |
3-4月大鼠 | 海馬塊包括皮質(zhì) | 鹽水灌注,11天 |
P6小鼠 | 全腦 | 無灌注,8天 鹽水灌注,7天 |
2-3月小鼠 | 全腦 | 鹽水灌注,10天 |
5月小鼠 | 半球 | 無灌注,11-12天 鹽水灌注,11天 |
組織塊的類型和大小的不同可能影響浸漬時(shí)間,理想的時(shí)間應(yīng)該通過實(shí)驗(yàn)研究獲得。在大多數(shù)情況下較好的浸漬效果是在2周。如果浸漬超過2周,則可能出現(xiàn)非特異性染色體。
2.浸漬后:浸漬準(zhǔn)備好后,用蒸餾水或去離子水(dH2O)沖洗組織塊,然后將其轉(zhuǎn)移到套件B所制備的浸漬后緩沖液(30 g稀釋在90 ml dH2O)中,并在室溫下避光儲(chǔ)存。 在浸泡一天后更新溶液,繼續(xù)浸泡一天。 在浸漬后2天后,將組織塊準(zhǔn)備好切片。
組織塊可以在4°C的緩沖液中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月
3.切片:可以使用振動(dòng)切片機(jī)或類似類型的切片機(jī)將大腦切割成厚度為100-200μm的切片。
切片應(yīng)收集在套件B所制備的收集和安裝緩沖液(30g試劑B,在500ml dH2O中稀釋)中。
建議使用振動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī)進(jìn)行切片。如果切片機(jī)刻度范圍為1-10,則將速度和振幅設(shè)置為4級(jí)。 建議在分析樹枝狀分枝和樹突棘時(shí)使用100-200μm的厚度。 對(duì)于薄切片的切割(例如50μm),需將剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分鐘來去除刀片上的油漬。
切片過程可在溫度設(shè)定在-16°C ~ -20°C的低溫恒溫器中進(jìn)行。
4.安裝:借助所提供的著色筆(大),將切片轉(zhuǎn)移到裝有收集和安裝緩沖液的填充盤(例如95×15mm培養(yǎng)皿)中。 使用圓頭筆(小),將切片安裝在粘性顯微鏡載玻片上。 1個(gè)載玻片上可安裝6~12個(gè)切片。
覆蓋切片:用吸水紙(例如濾紙)覆蓋濕的切片,然后通過輕壓載玻片來給吸水紙壓力,以增強(qiáng)切片與載玻片的粘附。
在室溫下風(fēng)干燥切片約1分鐘。 長(zhǎng)時(shí)間暴露在干燥空氣中會(huì)導(dǎo)致切片破碎。
將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中(已提供)。 放置在封閉的染色罐中的載玻片可以在室溫下儲(chǔ)存一天。一個(gè)染色罐可以存儲(chǔ)多達(dá)10個(gè)載玻片。
5.染色:用0.01M PBS-T洗滌載玻片20~30分鐘,然后用dH2O洗滌約1分鐘。 將載玻片置于用dH2O稀釋后的溶液C(體積比 3:5)中,在封閉的染色罐中保持20±2分鐘(將罐子儲(chǔ)存在黑暗區(qū)域中),然后將載玻片在dH2O中漂洗約1分鐘。
如“試劑盒提供的材料”中所述:溶液C必須在使用前用dH2O(體積比為3:5)稀釋。例如,將18ml溶液C與30ml dH2O混合,形成48ml工作溶液。試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,在所提供的染色罐中總共10個(gè)載玻片,每個(gè)載玻片黏附有12個(gè)鼠腦切片)。
為獲得宜效果,請(qǐng)勿重復(fù)使用稀釋的工作溶液。
為了防止切片滑落,切勿在dH2O中長(zhǎng)時(shí)間洗滌。理想的染色時(shí)間應(yīng)由實(shí)驗(yàn)研究獲得。通常較好的染色效果是在20分鐘左右。
6.復(fù)染色:將載玻片置于試劑D所制備的復(fù)染緩沖液中,在暗處中放置20分鐘后在0.01M PBS-T中洗滌10分鐘×3次。
(可選染劑:在PBS-T洗滌后,切片可用甲酚紫、甲基綠或其他合適的染色試劑復(fù)染。)
用dH2O沖洗載玻片約1分鐘,然后風(fēng)干。當(dāng)切片不*干燥(通常需要5~10分鐘)時(shí),將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中,或繼續(xù)下一步操作“清潔和覆蓋”。
載玻片可以在室溫條件下儲(chǔ)存在罐中一天。
為了防止長(zhǎng)時(shí)間暴露在干燥空氣導(dǎo)致切片的碎片化,需將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中。
48ml復(fù)染緩沖液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,如“5.染色”中所述,在染色罐中的12個(gè)切片×10個(gè)切片)。 為獲得宜效果,請(qǐng)勿重復(fù)使用工作溶液。
7.清潔和覆蓋:將載玻片在100%乙醇中脫水約10分鐘 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗約10分鐘 ×3次。 蓋玻片采用的是Permount®封片劑。
將superGolgi-染色用的切片儲(chǔ)存在室溫和黑暗區(qū)域。
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