QuickZyme Biosciences是一家創(chuàng)新的生命科學(xué)公司，為研究界提供新穎*的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品在基質(zhì)相關(guān)蛋白，酶和測(cè)定法領(lǐng)域具有附加值。

上海起發(fā)Quickzyme QZBtotcol1現(xiàn)貨使用說(shuō)明書(shū)

介紹

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一。膠原生成的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致纖維化（過(guò)多的膠原）或骨關(guān)節(jié)炎（過(guò)少的膠原）等病理變化。

因此，在許多情況下，膠原蛋白的測(cè)定是很重要的

疾病相關(guān)研究。

quickzyme總膠原測(cè)定是基于羥脯氨酸的檢測(cè)。羥脯氨酸是一種非蛋白性氨基酸，存在于哺乳動(dòng)物的彈性蛋白和膠原蛋白中。它的存在主要局限于膠原的三螺旋，在那里它的存在增加了三螺旋的穩(wěn)定性。羥脯氨酸是在脯氨酸羥化酶的作用下由特定的脯氨酸殘基翻譯后形成的。組織水解物中的羥脯氨酸可以直接測(cè)量膠原蛋白的含量。

膠原的測(cè)定是從組織樣品在95oC的6M HCl中*水解開(kāi)始的。水解產(chǎn)物中的羥脯氨酸殘基通過(guò)對(duì)prockop和udenfriend（anal）所述方法的改進(jìn)進(jìn)行定量。Biochem.，1960，1:228-239）。該分析測(cè)量了樣品中羥脯氨酸的總量，它代表了樣品中存在的所有類(lèi)型的膠原，而不區(qū)分膠原類(lèi)型和前膠原、成熟膠原和膠原降解。

產(chǎn)品

該測(cè)定是簡(jiǎn)單的，并且結(jié)果在570 nm處具有大的吸光度。這種分析方法的發(fā)展使得它不需要酸水解后的干燥步驟，而酸水解通常需要特殊的設(shè)備。

Total Collagen Assay

總膠原測(cè)定

總膠原蛋白測(cè)定試劑盒基于對(duì)膠原蛋白進(jìn)行酸水解而獲得的羥脯氨酸殘留的定量比色測(cè)定。通常，對(duì)于該分析，需要水解除去HCl，這是一個(gè)耗時(shí)的步驟，并且/或者需要特殊的設(shè)備。QuickZyme總膠原蛋白測(cè)定法是僅有不需要此繁瑣步驟的基于羥脯氨酸的測(cè)定法，可在水解步驟后進(jìn)行快速（<2小時(shí)）且簡(jiǎn)便（96孔板形式）的測(cè)定。

膠原蛋白測(cè)定總規(guī)格

• 定量測(cè)量所有類(lèi)型的膠原蛋白，種類(lèi)無(wú)關(guān)。
• 樣品：細(xì)胞提取物，組織勻漿，組織。
• 比色法測(cè)定羥脯氨酸含量
• 范圍：6至300μg/ ml。靈敏度：2.5 µg / ml
• 以鼠尾膠原蛋白為標(biāo)準(zhǔn)
• 易用性：相當(dāng)于ELISA
• 室溫保存

價(jià)格/產(chǎn)品編號(hào)-訂單

各種膠原的定量測(cè)定

•與物種無(wú)關(guān)

•570 nm下的比色讀出

•快速簡(jiǎn)便

•動(dòng)態(tài)范圍廣

•基于羥脯氨酸的分析

•獨(dú)立于提取方法

•無(wú)需特殊設(shè)備！

分析規(guī)格

動(dòng)態(tài)范圍：6-300微克/毫升

靈敏度：2.5微克/毫升

樣品體積：50-500微升

格式：96孔板

用途：非常廣泛的應(yīng)用：條件培養(yǎng)基

細(xì)胞/細(xì)胞提取物組織/組織提取物物種無(wú)關(guān)膠原類(lèi)型無(wú)關(guān)

盒子里有什么？

包括標(biāo)準(zhǔn)、緩沖器和板。水解管，微量板，膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，緩沖液，檢測(cè)試劑，板封。不包括鹽酸。

其他所需材料

需要但不提供以下材料和設(shè)備：

•12M和6M HCl用于樣品水解

•4M HCl用于樣品和標(biāo)準(zhǔn)稀釋

•單通道和/或多通道移液管

•Eppendorf離心機(jī)

•恒溫箱（或溫度計(jì)或校準(zhǔn)烤箱），用于在95攝氏度（不高于?。?/p>

•在60℃下加熱的培養(yǎng)箱

•可在540至580納米之間測(cè)量波長(zhǎng)的微板閱讀器，優(yōu)選570納米。

•微孔板振動(dòng)篩

•聚丙烯、聚乙烯或玻璃管（不含聚苯乙烯）

定量測(cè)量

儲(chǔ)存條件

未打開(kāi)的工具包：

在黑暗中室溫（RT）下儲(chǔ)存。不要使用超過(guò)套件有效期的套件組件。

打開(kāi)的試劑盒/重組試劑：

打開(kāi)的膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和分析緩沖液應(yīng)在4℃下避光保存。其他打開(kāi)的試劑應(yīng)在室溫下避光保存，并至少穩(wěn)定1個(gè)月。重組檢測(cè)試劑（A+B）應(yīng)在重組當(dāng)天使用。

預(yù)防措施

該試劑盒含有正丙醇、高氯酸、乙酸和二甲基亞砜。請(qǐng)參閱相關(guān)的MSDS:www.quickzyme。。ｃｏｍ/products/total-collagenassay。在2019年1月4日樣品水解和使用試劑盒時(shí)，在總膠原蛋白分析期間佩戴眼睛、手、臉和衣物保護(hù)裝置。在通風(fēng)柜中進(jìn)行分析。

臨界參數(shù)

•此類(lèi)分析可顯示基質(zhì)效應(yīng)：樣品中影響信號(hào)的干擾因素。通過(guò)稀釋水解液可以避免這種影響。如果使用樣品類(lèi)型，應(yīng)測(cè)試各種稀釋液，直到獲得A570與稀釋液的線(xiàn)性。應(yīng)用說(shuō)明中給出了幾種小鼠組織的建議稀釋液（見(jiàn)我們網(wǎng)站上的產(chǎn)品頁(yè)）。如果對(duì)于您的特定樣品類(lèi)型，為避免基質(zhì)效應(yīng)所需的稀釋導(dǎo)致A570值非常低，我們建議使用

Quickzyme敏感組織膠原試劑盒。

•水解發(fā)生在95攝氏度（不高于?。?0小時(shí)。螺絲帽

管子應(yīng)該用手緊緊地關(guān)上。如果管不嚴(yán)密，水解液將蒸發(fā)。

•在分析的后一步中，在60℃下顯色的培養(yǎng)時(shí)間為1小時(shí)。這是基于在烤箱中孵化。當(dāng)在平板培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)（培養(yǎng)箱和平板之間緊密接觸），縮短的培養(yǎng)時(shí)間（20-30分鐘）就足夠了。

•當(dāng)將分析緩沖液添加到35μl（稀釋?zhuān)┧庖褐袝r(shí)，會(huì)出現(xiàn)渾濁的外觀，在一分鐘內(nèi)消失，不會(huì)影響分析。

•在低溫下，分析緩沖液可能含有一些晶體。這些可以通過(guò)加熱溶解。

在室溫下，試劑A可能變成凝膠或固體，在37℃加熱，渦旋將解決這個(gè)問(wèn)題。

緩沖液/試劑制備

•分析緩沖液已準(zhǔn)備好使用

•用于制備檢測(cè)試劑混合物2體積的檢測(cè)試劑A和3體積的檢測(cè)試劑B。

檢測(cè)試劑B和濃縮試劑A+B可能會(huì)腐蝕某些類(lèi)型的塑料。對(duì)于這些溶液的移液，使用聚丙烯或聚乙烯移液管，或玻璃移液管。A+B溶液應(yīng)在PP、PE或玻璃管中制成。不建議使用聚苯乙烯或PET。

試劑盒中提供的96孔板對(duì)分析中存在的稀釋A+B溶液具有抗性。檢測(cè)試劑B和A+B混合物具有腐蝕性，應(yīng)小心處理。在通風(fēng)柜中工作，使用適當(dāng)?shù)难劬兔娌勘Ｗo(hù)，并戴手套。

樣品制備（1）

-細(xì)胞提取物

將細(xì)胞提取物（50–250μl）轉(zhuǎn)移到螺旋蓋管中，并用12M HCl（終濃度6M HCl）以1:1（v/v）稀釋。建議至少使用50μl樣品和50μl 12M HCl。在放入烤箱之前，請(qǐng)將管子關(guān)緊。另請(qǐng)參見(jiàn)上面的關(guān)鍵參數(shù)。

-組織

a.組織勻漿

組織勻漿的處理與上述條件培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物的處理類(lèi)似。

b.組織樣本

對(duì)組織樣品（濕的或干的）進(jìn)行稱(chēng)重，并將其轉(zhuǎn)移到螺旋蓋管中。所需的組織數(shù)量高度依賴(lài)于組織中的膠原蛋白水平。作為指示，根據(jù)組織的類(lèi)型和數(shù)量，添加6M HCl以獲得50-300 mg組織/ml。建議小體積為100μl。

樣品制備（2）

管子必須非常緊密地閉合（從上面可以很清楚地看到橡膠圈），并在95℃下在校準(zhǔn)的烤箱或熱塊中孵育20小時(shí)（不要在更高的溫度下孵育）。孵育后，將試管冷卻至室溫。在達(dá)到室溫之前不要打開(kāi)管子。試管在eppendorf離心機(jī)中以13000 x g離心10分鐘。上清液用于進(jìn)一步分析。由于脂肪和碳水化合物的降解而產(chǎn)生的棕色或黑色顆?？赡艽嬖冢ㄟ^(guò)離心很難*去除。顆粒的數(shù)量取決于樣品。轉(zhuǎn)移上清液時(shí)盡量避免用移液管移取顆粒。除了擋住光路之外，這些微粒不會(huì)干擾分析。

首先用半水稀釋水解樣品：1體積樣品+0.5體積水（例如200微升水解物+100微升水）。樣品現(xiàn)在在4M HCl中。可能需要的所有進(jìn)一步稀釋?zhuān)ㄒ?jiàn)“關(guān)鍵參數(shù)”中的備注）應(yīng)使用4M HCl進(jìn)行。試驗(yàn)中使用35μl稀釋水解樣品進(jìn)行分析。

標(biāo)準(zhǔn)制備

膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品以1200μg/ml的儲(chǔ)備量在0.02m醋酸中提供。

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)，將本標(biāo)準(zhǔn)的125μl轉(zhuǎn)移到螺旋蓋管中，并與等量（125μl）的12M HCl（6M HCl中的終濃度為600μg/ml）混合。管子非常緊密地閉合（橡膠圈應(yīng)清晰可見(jiàn)），并在95攝氏度（不高于）下孵育20小時(shí)。在經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的烤箱或溫度計(jì)中。孵育后，將試管冷卻至室溫，并在13000 x g的eppendorf離心機(jī)中離心10分鐘。

上清液用于進(jìn)一步分析。將8個(gè)Eppendorf管標(biāo)記為S1-S8。s1至s7為水解料的稀釋液，s8為空白。用水和4M HCl進(jìn)行首輪稀釋?zhuān)哉{(diào)整至4M HCl濃度。根據(jù)以下方案，在4M HCl中進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。結(jié)果得到如下標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)：300μg/ml（s1）；200μg/ml（s2）；100μg/ml（s3）；50μg/ml（s4）；25μg/ml（s5）；12.5μg/ml（s6）；6.25μg/ml（s7）；0μg/ml（s8）。稀釋后將所有標(biāo)準(zhǔn)品充分混合。每種標(biāo)準(zhǔn)品35μl用于分析

膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)樣品制備的移液方案

分析程序

建議對(duì)所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，一式兩份

一。按照“樣品制備”中的說(shuō)明制備樣品。

2.按照“標(biāo)準(zhǔn)制備”中的說(shuō)明制備膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

三。用移液管將35微升標(biāo)準(zhǔn)溶液移到分析微孔板的適當(dāng)孔中。

四。用移液管將35μl稀釋的水解未知樣品（在4M HCl中）移到適當(dāng)?shù)目字小?/p>

5個(gè)。每孔加入75μl試液，混勻。

6.用一個(gè)封閉的膠粘板封條蓋住板，在室溫下孵育20分鐘，同時(shí)搖動(dòng)板。

7。通過(guò)檢測(cè)試劑A和B2:3（RESP 30μL＋45 L L/阱）混合，制備一套足以檢測(cè)待測(cè)威爾斯（75μL/阱）的試劑。

8。小心地拆下板密封件

9。每口井加入75μl檢測(cè)試劑。

10。用封閉的粘合板密封件蓋住板。

11。搖動(dòng)盤(pán)子使之充分混合。在60°C的烘箱中培養(yǎng)60分鐘（不要使用更高或更低的溫度）。

12。把盤(pán)子放在冰上冷卻5分鐘至室溫

13?；旌习宀⑿⌒牡夭鹣掳迕芊饧?/p>

14。清潔板底部，在570 nm（可接受540-580 nm）下讀取板并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

數(shù)據(jù)分析

有幾種方法可用于計(jì)算分析樣品中的膠原蛋白濃度。建議使用回歸曲線(xiàn)擬合程序的軟件包處理數(shù)據(jù)。如果不可用，可以手動(dòng)計(jì)算膠原蛋白濃度，如下所示。

-平均每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的重復(fù)讀數(shù)，并從所有讀數(shù)中減去平均空白。

-通過(guò)繪制Y軸上的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的A570（減去空白）與XXAX（0 - 3.13 - 6.25 - 12.5 - 25 - 50 - 100 - 200 - 300μg膠原蛋白/ml水解物）上的膠原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)圖形上的點(diǎn)繪制宜擬合線(xiàn)性化曲線(xiàn)。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將試驗(yàn)樣品的A570值轉(zhuǎn)換為μg/ml膠原。這就得到了水解樣品中的膠原蛋白濃度。如果水解后包括稀釋步驟，則濃度應(yīng)乘以2019年1月8日的稀釋總膠原蛋白含量因子，得出水解樣品中的膠原蛋白濃度。根據(jù)樣品制備，可以計(jì)算原始樣品中的膠原蛋白量。

典型數(shù)據(jù)

所示數(shù)據(jù)曲線(xiàn)僅供演示。準(zhǔn)確的a570值在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中可能略有不同。

典型的膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

相關(guān)產(chǎn)品：

-Soluble collagen assay 

- Hydroxyproline assay

- Human and mouse MMP-9 activity assay

- Human and mouse MMP-2 activity assay