上海起發(fā)脂多糖提取試劑盒等你來拿!
LPS Extraction Kit 脂多糖提取試劑盒
iNtRON17141 100 Prep
脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。其功能包括抗吞噬、抗血清、外膜通透性屏障和作為某些噬菌體吸附受體。熱酚水提取法是提取脂多糖的常用方法,但提取時間長,步驟復(fù)雜。當(dāng)我們試圖操縱如此少量的細(xì)胞時,這種方法有很大的局限性。LPS提取試劑盒是專為快速、簡便地從細(xì)菌細(xì)胞中提取LPS而設(shè)計的,廣泛適用于不同的革蘭氏細(xì)菌,適合于細(xì)胞數(shù)量較少的情況。首先。細(xì)菌細(xì)胞被有機溶液溶解。細(xì)胞膜的磷脂和蛋白質(zhì)成分被破壞,細(xì)胞成分在溶液中釋放。第二步。用高鹽濃度溶液純化釋放細(xì)胞組分中的脂多糖。第三步。對于高質(zhì)量的脂多糖,洗滌和洗脫鹽通過洗滌步驟被簡單地除去 。
•廣泛應(yīng)用于不同的革蘭氏陰性菌中
•僅需60分鐘即可提取出脂多糖
•可重復(fù)地獲得較高的脂多糖產(chǎn)量
儲存:
在4℃下儲存,然后穩(wěn)定至少一年。
試劑盒包含:
LPS Extraction Kit 100 Preps
Lysis Buffer 100 ml Purification Buffer 80 ml
使用前配制溶液 :
70%乙醇,
室溫10mmTris-HCl緩沖液(pH8.0)
蛋白酶K溶液(30∏/ml)
LPS提取率與培養(yǎng)體積成正比當(dāng)使用5ml培養(yǎng)物時,LPS的產(chǎn)率達到大值。我們不建議處理超過5毫升的細(xì)菌培養(yǎng)物。如果使用過量的培養(yǎng)液,將降低裂解率和產(chǎn)量,增加細(xì)胞蛋白對脂多糖的污染。通常,在OD600為0.8-1.2時,宜培養(yǎng)體積為2毫升。
為從細(xì)菌細(xì)胞中獲得高純度的脂多糖,用蛋白酶K處理,按以下步驟提取脂多糖。
協(xié)議:
1.在13000轉(zhuǎn)/分鐘的室溫下離心,獲得2-5毫升細(xì)菌細(xì)胞。注意:清除上清液的所有痕跡。對于成粒細(xì)胞,在使用前通過重復(fù)敲擊試管*松開細(xì)胞顆粒。細(xì)胞顆粒的不*松動可能導(dǎo)致無效的溶解和降低產(chǎn)量。
2。加入1毫升裂解緩沖液,用力旋渦。注:為促進細(xì)菌細(xì)胞溶解,應(yīng)大力旋渦直至細(xì)胞團消失。
3。加入200毫升氯方后,用力旋渦10-20秒。室溫下孵育5分鐘,注意:旋渦前觀察試管。當(dāng)加入氯方時,當(dāng)氯方層向下移動時,會在上層(藍(lán)色層)的正下方形成一條白線。這個區(qū)域包含細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、基因組DNA和RNA的混合部分。加入氯方的目的是分離酚層和水層,并終分離RNA和基因組DNA/蛋白質(zhì)。
4。以13000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4℃下離心10分鐘。將400毫升上清液移入新的1.5毫升試管中。注:上層移液時,注意形成白色沉淀物。
5。加入800ml純化緩沖液,充分混合。在-20℃下孵育10分鐘。注:本步驟的目的是從細(xì)胞的其他提取物(如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等)中純化脂質(zhì)6。在4℃下以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘后,除去上層以獲得LPS顆粒。7號。加入1毫升70%乙醇,倒置試管2-3次,洗滌脂多糖顆粒。將混合物在4℃13000轉(zhuǎn)/分下離心3分鐘。丟棄上層并干燥剩余的LPS顆粒。
注:這是一個清洗階段,用于去除雜質(zhì),如鹽等。在RT.8干燥顆粒。將30–50毫升10毫升Tris HCl緩沖液(pH 8.0)加入到LPS顆粒和渦流管或移液管中。將LPS煮沸2分鐘,使其*溶解。選擇:用蛋白酶K處理,從細(xì)菌細(xì)胞中提取高純度的LPS。每1個LPS處理2.5?蛋白酶K,在50℃孵育30分鐘。通常從大腸桿菌中提取30?LPS。
1.在13000轉(zhuǎn)/分鐘的室溫下離心,獲得2-5毫升細(xì)菌細(xì)胞。注意:清除上清液的所有痕跡。對于成粒細(xì)胞,在使用前通過重復(fù)敲擊試管*松開細(xì)胞顆粒。細(xì)胞顆粒的不*松動可能導(dǎo)致無效的溶解和降低產(chǎn)量。
2。加入1毫升裂解緩沖液,用力旋渦。注:為促進細(xì)菌細(xì)胞溶解,應(yīng)大力旋渦直至細(xì)胞團消失。
3。加入200毫升氯方后,用力旋渦10-20秒。室溫下孵育5分鐘,注意:旋渦前觀察試管。當(dāng)加入氯方時,當(dāng)氯方層向下移動時,會在上層(藍(lán)色層)的正下方形成一條白線。這個區(qū)域包含細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、基因組DNA和RNA的混合部分。加入氯方的目的是分離酚層和水層,并終分離RNA和基因組DNA/蛋白質(zhì)。
4。以13000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4℃下離心10分鐘。將400毫升上清液移入新的1.5毫升試管中。注:上層移液時,注意形成白色沉淀物。
5。加入800ml純化緩沖液,充分混合。在-20℃下孵育10分鐘。注:本步驟的目的是從細(xì)胞的其他提取物(如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等)中純化脂質(zhì)
6。在4℃下以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘后,除去上層以獲得LPS顆粒。
7。加入1毫升70%乙醇,倒置試管2-3次,洗滌脂多糖顆粒。將混合物在4℃13000轉(zhuǎn)/分下離心3分鐘。丟棄上層并干燥剩余的LPS顆粒。
注:這是一個清洗階段,用于去除雜質(zhì),如鹽等。在RT.8干燥顆粒。將30–50毫升10毫升Tris HCl緩沖液(pH 8.0)加入到LPS顆粒和渦流管或移液管中。將LPS煮沸2分鐘,使其*溶解。選擇:用蛋白酶K處理,從細(xì)菌細(xì)胞中提取高純度的LPS。每1個LPS處理2.5?蛋白酶K,在50℃孵育30分鐘。通常從大腸桿菌中提取30?LPS。
Cell culture volume(OD600=1.0) 2?(109 cells)
Yield of LPS 30?
Amount of Proteinase K 75?(2.5?of 30㎎/ ml PK)
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