KAMIYA KT-26867說(shuō)明書
KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY
人蛋白零點(diǎn),髓鞘 (MPZ) ELISA
目錄號(hào)編號(hào)KT-26867
僅供研究使用。不得用于診斷程序。
產(chǎn)品信息
人蛋白零點(diǎn),髓鞘 (MPZ) ELISA
目錄號(hào)編號(hào)KT-26867
Human Protein Zero, Myelin
(MPZ) ELISA
預(yù)期用途
該試劑盒是一種夾心酶免疫分析法,用于體外定量測(cè)定組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的人 MPZ。僅供研究使用。不適用于 用于診斷程序。
試劑 | 數(shù)量 |
預(yù)包被、即用型 96 孔板條板 | 1 |
校準(zhǔn)品(凍干) | 2 |
校準(zhǔn)品稀釋液 | 1 × 20 mL |
檢測(cè)試劑 A | 1 × 120 µL |
檢測(cè)試劑 B | 1 × 120 µL |
試驗(yàn)稀釋劑 A(2X 濃縮液) | 1 × 6 mL |
試驗(yàn)稀釋劑 B(2X 濃縮液) | 1 × 6 mL |
TMB 底物 | 1 × 9 mL |
終止液 | 1 × 6 mL |
清洗緩沖液(30X 濃縮液) | 1 × 20 mL |
96 孔封板膜 | 4 |
需要但未提供的材料
所有試劑應(yīng)根據(jù)小瓶上的標(biāo)簽進(jìn)行保存。接收后,校準(zhǔn)品、檢測(cè)試劑 A、檢測(cè)試劑 B 和 96 孔板條應(yīng)儲(chǔ)存在-20 ℃。未使用的試劑條應(yīng)保存在密封袋中,并提供干燥劑,以盡量減少暴露于潮濕空氣中。開封的檢測(cè)試劑盒將在所示失效日期前保持穩(wěn)定,前提是其按照上述規(guī)定儲(chǔ)存。
該試劑盒中提供的微量滴定板已用 MPZ 特異性抗體預(yù)包被。然后將校準(zhǔn)品或樣品加入到含有 MPZ 特異性生物素結(jié)合抗體制劑的適當(dāng)微量滴定板孔中。然后,向每個(gè)微孔板小孔中加入與辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 結(jié)合的抗生物素蛋白并孵育。然后向各孔中加入 TMB 底物溶液。只有那些含有 MPZ、生物素偶聯(lián)抗體和酶偶聯(lián)抗生物素蛋白的孔才會(huì)出現(xiàn)顏色變化。
加入硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng),并采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定顏色變化。然后通過(guò)比較樣品的 O.D. 值與校準(zhǔn)曲線,測(cè)定樣品中 MPZ 的濃度。
組織勻漿的制備因組織類型而異。對(duì)于本試驗(yàn),在冰冷 PBS (0.02 mol/L,pH 7.0-7.2) 中沖洗組織,以*除去過(guò)量血液,并在勻漿前稱重。將組織制成小塊,置于冰上,用玻璃勻漿器在 5-10 mL PBS 中勻漿化(Micro tissue Grinders 也工作)。用超聲細(xì)胞破碎儀對(duì)所得混懸液進(jìn)行超聲處理或進(jìn)行兩次凍融循環(huán)以進(jìn)一步破碎細(xì)胞膜。然后,將勻漿在 5,000 xg 下離心 5 min。立即除去上清液并進(jìn)行試驗(yàn),或等分并儲(chǔ)存在≤-20 ℃ 下。
以 1,000 xg 離心樣品 20 min。立即除去微粒并進(jìn)行測(cè)定,或?qū)悠返确衷嚇觾?chǔ)存在-20 ℃ 或-80 ℃ 下備用。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
注:
1. 5 天內(nèi)使用的樣品可在 4 ℃ 下儲(chǔ)存,否則樣品必須在-20 ℃(≤1 個(gè)月)或-80 ℃(≤2 個(gè)月)下儲(chǔ)存,以避免生物活性損失和污染。
使用前,將所有試劑盒組分和樣本置于室溫 (18-25 ℃) 下。
用 0.1 mL 校準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶校準(zhǔn)品,在室溫下保持 10 min,輕輕振搖(不要起泡)。儲(chǔ)備液中校準(zhǔn)品的濃度為 10 ng/mL。請(qǐng)制備 7 支含 0.5 mL 校準(zhǔn)品稀釋液的試管,并根據(jù)下圖制備雙倍稀釋系列。在下一次轉(zhuǎn)移前,充分混合各試管。設(shè)置 7 個(gè)點(diǎn)的稀釋校準(zhǔn)品,如 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL,后一個(gè)含有校準(zhǔn)品稀釋液的 EP 管作為空白 (0 ng/mL)。
管 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
ng/mL | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0.156 | 0 |
用 6 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 6 mL 試驗(yàn)稀釋劑 A 或 B 濃縮液 (2X),制備 12 mL 試驗(yàn)稀釋劑 A 或 B。制備的工作稀釋液不能冷凍。
使用前短暫旋轉(zhuǎn)或離心儲(chǔ)備檢測(cè)試劑 A 和檢測(cè)試劑 B。分別用工作試驗(yàn)稀釋劑 A 或 B 稀釋至工作濃度 (1:100)。
用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 清洗液濃縮液 (30X),制備 600 mL 清洗液 (1X)。
用無(wú)菌吸頭吸取所需劑量的溶液,不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。
1. 不允許在孔中直接進(jìn)行連續(xù)稀釋。
2. 在測(cè)定前 15 min 內(nèi)制備校準(zhǔn)品。請(qǐng)勿在 37 ℃ 下直接溶解試劑。
4. 復(fù)溶的校準(zhǔn)品、檢測(cè)試劑 A 和檢測(cè)試劑 B 只能使用一次。
5. 如果在清洗溶液濃縮液 (30X) 中形成晶體,則加熱至室溫并輕輕混合,直至晶體*溶解。
6. 試劑配制用水或容器受污染會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
2. 請(qǐng)?jiān)跍y(cè)定前預(yù)測(cè)濃度。如果這些值不在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),則用戶必須確定其特定實(shí)驗(yàn)的宜樣本稀釋度。
3. 如果手冊(cè)中未指明樣本,則需要進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)以確定試劑盒的有效性。
4. 用化學(xué)裂解緩沖液制備的組織或細(xì)胞提取樣品,由于某些化學(xué)物質(zhì)的影響,可能會(huì)引起意想不到的 ELISA 結(jié)果。
6. 受細(xì)胞活性、細(xì)胞數(shù)量和取樣時(shí)間等因素的影響,試劑盒可能無(wú)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本。
7. 建議使用未經(jīng)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的新鮮樣本進(jìn)行試驗(yàn)。否則,這些樣品可能發(fā)生蛋白質(zhì)降解和變性,終導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
2. 清除每個(gè)孔中的液體,不要清洗。
6. 按照步驟 4 重復(fù)抽吸/清洗過(guò)程 5 次。
注:
6. TMB 底物容易被污染。請(qǐng)避光保存。
7. 小于 60% 的環(huán)境濕度可能會(huì)對(duì)終性能產(chǎn)生一些影響,因此,建議在該條件下使用濕化器。
計(jì)算各校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本重復(fù)兩次讀數(shù)的平均值,并減去平均零校準(zhǔn)品光密度。在 log-log 圖形紙上創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,y 軸為 MPZ 濃度,x 軸為吸光度。通過(guò)校準(zhǔn)品點(diǎn)繪制宜擬合直線,可通過(guò)回歸分析確定。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋,則從校準(zhǔn)曲線中讀取的濃度必須乘以稀釋因子。
0.156–10 ng/mL。
用于 ELISA 的校準(zhǔn)曲線濃度為 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL。
人 MPZ 的小可檢測(cè)劑量通常低于 0.052 ng/mL。本試驗(yàn)的靈敏度或檢測(cè)下限 (LLD) 定義為可與零區(qū)分的低蛋白濃度。測(cè)定零校準(zhǔn)品 20 次重復(fù)測(cè)定的平均 O.D. 值加上 3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
該方法檢測(cè)人 MPZ 具有較高的靈敏度和*的特異性。未觀察到人 MPZ 和類似物之間存在顯著的交叉反應(yīng)性或干擾。
注:受當(dāng)前技能和知識(shí)的限制,我們不可能完成人 MPZ 與所有類似物的交叉反應(yīng)檢測(cè),因此交叉反應(yīng)可能仍然存在。
1. 準(zhǔn)備所有試劑、樣本和校準(zhǔn)品;
2. 向每個(gè)孔中加入 100µL 校準(zhǔn)品或樣本。在 37 ℃ 下孵育 2 小時(shí);
3. 加入 100µL 制備好的檢測(cè)試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時(shí);
4. 抽吸并清洗 3 次;
5. 加入 100µL 制備好的檢測(cè)試劑 B。在 37 ℃ 下孵育 30 min;
6. 抽吸并清洗 5 次;
7. 加入 90µL 底物溶液。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min;
8. 加入 50µL 終止液。立即在 450 nm 處讀數(shù)。
1. 終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將與終端用戶的操作技能和實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。請(qǐng)確保有足夠的樣本可用。
3. 請(qǐng)勿將一批試劑盒中的試劑混合或替換為另一批試劑盒。僅使用制造商提供的試劑。
4. 儲(chǔ)存和孵育期間,所有試劑均應(yīng)避免強(qiáng)光照射。所有試劑瓶蓋應(yīng)蓋緊,防止微生物蒸發(fā)和污染。
僅供研究使用。不得用于診斷程序。
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