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Eagle Biosciences人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

更新時(shí)間:2020-09-07      點(diǎn)擊次數(shù):1162

Eagle Biosciences人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-21)ELISA

 

目錄號(hào):

F2131-K01(1 × 96孔)

僅供研究使用。不得用于診斷程序。

v. 1.0

EagleBiosciences,Inc.

預(yù)期用途

Eagle Biosciences人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)ELISA檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫分析試劑盒)預(yù)期用于定量測(cè)定血清中人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)的水平。Eagle Biosciences人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)ELISA檢測(cè)試劑盒僅供研究使用,不用于診斷程序。

 

引言

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)屬于FGF-19亞家族,包括FGF-19、FGF-21和FGF-23。FGF-19家族成員是調(diào)節(jié)多種生理穩(wěn)態(tài)的強(qiáng)效內(nèi)分泌激素。

 

完整的FGF-21是由181個(gè)氨基酸組成的小蛋白。在一系列胰島素抵抗動(dòng)物模型中,給予重組FGF21可降低血糖和胰島素水平,降低肝臟和循環(huán)甘油三酯和膽固醇水平,并改善胰島素敏感性、能量消耗、肝臟脂肪變性和肥胖。FGF-21的生理功能依賴于其N末端和C末端區(qū)域的完整分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。N端截短的FGF-21(7-181)是一種強(qiáng)效抑制劑,可競(jìng)爭(zhēng)性抑制完整FGF-21(1-181)的生物活性。因此,測(cè)量循環(huán)完整FGF-21水平在生理和病理生理狀況評(píng)估中具有重要意義。測(cè)定FGF-21片段的試驗(yàn)可能高估供試品中蛋白的生物活性。

 

循環(huán)FGF-21是一種生物標(biāo)志物,在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和肥胖患者中其水平升高。在庫(kù)欣綜合征患者、HIV-1誘導(dǎo)的脂肪代謝障礙患者和慢性腎病或終末期腎病(ESRD)患者中也發(fā)現(xiàn)循環(huán)FGF-21增加。

 

試驗(yàn)原理

Eagle Biosciences人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)ELISA檢測(cè)試劑盒的設(shè)計(jì)、開發(fā)和生產(chǎn)用于定量測(cè)定血清和EDTA血漿樣本中的人完整FGF-21。該試驗(yàn)采用雙位點(diǎn)“夾心”技術(shù)和與人完整FGF-21不同表位結(jié)合的兩種選定抗體。其中一種抗體與N-末端人FGF-21(1-7)特異性結(jié)合,另一種與C-末端人FGF-21(175-181)特異性結(jié)合。

 

將試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和患者樣本直接加入包被抗人FGF-21(1-7)特異性抗體的微孔板孔中。同時(shí),向各孔中加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗人FGF-21(175-181)特異性抗體。一個(gè)孵育期后,微量滴定孔壁上的抗體捕獲樣本中的人FGF-21,并洗去每個(gè)微量滴定孔中的未結(jié)合蛋白。形成“抗FGF-21抗體人完整FGF-21 HRP結(jié)合示蹤抗體”的“夾心”。在隨后的清洗步驟中除去未結(jié)合的示蹤抗體。為檢測(cè)該免疫復(fù)合物,將微孔與底物溶液在定時(shí)反應(yīng)中孵育,然后在分光光度酶標(biāo)儀中測(cè)定。與微量滴定孔壁上人完整FGF-21結(jié)合的免疫復(fù)合物的酶活性與樣本中完整FGF-21的量成正比。通過(guò)繪制吸光度與相應(yīng)人完整FGF-21濃度的曲線生成標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

直接根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定供試品中的FGF-21。

 

試劑:制備和儲(chǔ)存

接收后,該完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)ELISA檢測(cè)試劑盒必須儲(chǔ)存在2-8 ℃下。關(guān)于試劑盒的失效日期,請(qǐng)參閱試劑盒包裝盒上的標(biāo)簽。所有組分在失效日期前均保持穩(wěn)定。

 

使用前使所有試劑恢復(fù)至室溫。不同試劑盒批號(hào)的試劑不得合并或互換。

 

1. 抗人FGF-21抗體包被微孔板

一個(gè)微孔板,含有12 x 8孔可破碎條帶(共96孔),包被有人FGF-21抗體。將板框定并密封在含有干燥劑的箔拉鏈袋中。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲(chǔ)存,并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

2. 人FGF-21示蹤抗體

一個(gè)小瓶含有0.4 mL濃HRP標(biāo)記的抗人FGF-21抗體(穩(wěn)定蛋白基質(zhì)中)。使用前,必須用FGF-21示蹤劑抗體稀釋劑稀釋該試劑。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲(chǔ)存,并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

3. FGF-21示蹤抗體稀釋液

一個(gè)含有8 mL即用型緩沖液的小瓶。根據(jù)測(cè)定程序,應(yīng)僅用于示蹤抗體稀釋。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲(chǔ)存,并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

4. ELISA清洗濃縮液

每瓶含30 mL 30倍濃縮液。使用前,必須用870 mL去離子水稀釋內(nèi)容物,并混勻。稀釋后,得到含有表面活性劑的工作清洗液,溶于含有非疊氮化物、非汞防腐劑的磷酸鹽緩沖鹽水中。稀釋液應(yīng)在室溫下儲(chǔ)存,并在試劑盒上顯示的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

5. ELISA HRP底物

一瓶含有12 mL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和穩(wěn)定的過(guò)氧化氫。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲(chǔ)存,并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

6. ELISA終止液

每瓶含12 mL 0.5 M硫酸。該試劑應(yīng)儲(chǔ)存在2-8 ℃或室溫下,并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

7. 人FGF-21標(biāo)準(zhǔn)品

6個(gè)小瓶分別含有不同濃度的人FGF-21,溶于凍干牛血清基質(zhì)中,基質(zhì)中含非疊氮化物、非汞防腐劑。各標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確濃度參見(jiàn)小瓶。標(biāo)準(zhǔn)品可直接使用。這些試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲(chǔ)存,并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

8. 人FGF-21對(duì)照

兩個(gè)小瓶分別含有不同濃度的人FGF-21,溶于凍干牛血清基質(zhì)中,含非疊氮化物、非汞防腐劑。有關(guān)各質(zhì)控品的準(zhǔn)確濃度范圍,請(qǐng)參見(jiàn)小瓶。質(zhì)控品準(zhǔn)備就緒。兩種質(zhì)控品均應(yīng)儲(chǔ)存在2-8 ℃下,并在試劑盒包裝盒上標(biāo)注的失效日期前保持穩(wěn)定。

 

安全注意事項(xiàng)

人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)檢測(cè)試劑盒試劑必須在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中使用,且僅供研究使用,不得用于診斷程序。僅牛血清試劑來(lái)源的原材料來(lái)自美國(guó)連續(xù)48個(gè)國(guó)家。僅從獸醫(yī)監(jiān)督下飼養(yǎng)的供體健康動(dòng)物中獲得,發(fā)現(xiàn)無(wú)傳染病。進(jìn)行本試驗(yàn)時(shí)佩戴手套,并將這些試劑視為具有潛在傳染性進(jìn)行處理。避免接觸含有TMB、過(guò)氧化氫或硫酸的試劑。TMB可能會(huì)刺激皮膚和粘膜,引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)。TMB是一種疑似致癌物。硫酸接觸皮膚可能引起嚴(yán)重刺激。請(qǐng)勿接觸眼睛、皮膚或衣服。請(qǐng)勿攝入或吸入煙霧。接觸后,用大量水沖洗至少15 min。使用藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范。

 

需要但未提供的材料

· 能夠遞送25µL、50µL、100µL和1000µL的精密單通道移液器

· 重復(fù)適用于遞送100µL的分配器。

· 適用于上述體積分配的一次性移液器吸頭。

· 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。

· 帶蓋的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。

· 鋁箔。

· 去離子水或蒸餾水。

· 塑料微量滴定孔蓋或聚乙烯膜。

· ELISA多通道洗瓶或全自動(dòng)(半自動(dòng))洗滌系統(tǒng)。

· 能夠讀取450 nm處吸光度的分光光度酶標(biāo)儀。

 

樣本采集

僅需要50µL人EDTA血漿用于單峰人FGF-21測(cè)定。標(biāo)本采集前無(wú)需對(duì)個(gè)體進(jìn)行特殊準(zhǔn)備。應(yīng)使用紫色蓋的真空采血管采集全血,并通過(guò)離心(850-1500xg離心10 min)將血漿與細(xì)胞分離。應(yīng)在采集后立即或至少在采血后1小時(shí)內(nèi)將血漿與細(xì)胞分離。離心后應(yīng)立即將血漿轉(zhuǎn)移至潔凈試管中。如果在48小時(shí)內(nèi)不進(jìn)行測(cè)定,血漿樣本應(yīng)儲(chǔ)存在-20 ℃下。避免標(biāo)本凍融循環(huán)超過(guò)3次。

 

血清樣本也可用于FGF-21測(cè)定。血清樣本采集應(yīng)按照樣本采集管制造商的建議進(jìn)行。

 

樣本運(yùn)輸

收集的EDTA-血漿或血清樣本應(yīng)在冷凍條件下用干冰運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。如果冷凍條件不可用,樣本應(yīng)在

 

冷藏運(yùn)輸,例如,使用藍(lán)色冰袋運(yùn)輸。

 

 

試劑制備

1. 使用前,使所有試劑恢復(fù)至室溫。不同試劑盒批號(hào)的試劑不得組合或互換。

2. 使用前,必須將ELISA清洗濃縮液稀釋至工作溶液。詳細(xì)信息請(qǐng)參見(jiàn)試劑章節(jié)。

  • 向各小瓶中加入0.5 mL蒸餾水,復(fù)溶試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。使用前輕輕混合并溶解整個(gè)顆粒。復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品應(yīng)在使用后立即儲(chǔ)存在-20 ℃下。
  • 用FGF-21示蹤抗體稀釋劑(目錄號(hào)30600)以1:21倍稀釋結(jié)合抗體,制備工作人FGF-21示蹤抗體(目錄號(hào)30620)。下表概述了使用的試劑條與制備的抗體混合物之間的關(guān)系。

 

試紙編號(hào)。

FGF-21示蹤抗體稀釋液

FGF-21示蹤抗體

1

500 µL

25 µL

2

1000 µL

50 µL

3

1500 µL

75 µL

4

2000 µL

100 µL

5

2500 µL

125 µL

6

3000 µL

150 µL

7

3500 µL

175 µL

8

4000 µL

200 µL

9

4500 µL

225 µL

10

5000 µL

250 µL

11

5500 µL

275 µL

12

6000 µL

300 µL

注:該抗體混合物必須在臨檢測(cè)前新鮮制備。

 

 

試驗(yàn)程序

1. 將足夠數(shù)量的鼠IgG包被微孔板條/孔置于支架中,以一式兩份運(yùn)行人FGF-21標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和未知樣品。

 

2. 測(cè)試配置

世界其他地區(qū)

試劑條1

試劑條2

試劑條3

A

標(biāo)準(zhǔn)品1

標(biāo)準(zhǔn)品5

樣本1

B

標(biāo)準(zhǔn)品1

標(biāo)準(zhǔn)品5

樣本1

C

標(biāo)準(zhǔn)品2

標(biāo)準(zhǔn)品6

樣本2

D

標(biāo)準(zhǔn)品2

標(biāo)準(zhǔn)品6

樣本2

E

標(biāo)準(zhǔn)品3

C 1

樣品3

F

標(biāo)準(zhǔn)品3

C 1

樣品3

 

G

標(biāo)準(zhǔn)品4

C 2

 

H

標(biāo)準(zhǔn)品4

C 2

 

 

3. 向微孔中加入50µL標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和患者血漿/血清樣本。

4. 向各孔中加入50µL 1:21稀釋的示蹤抗體

5. 用封板覆膜覆蓋微孔板,并在室溫下通過(guò)定軌振搖170 rpm孵育微孔板2小時(shí)。

6. 取下封板膜。吸取各孔內(nèi)容物。向各孔中加入350µL工作清洗液,清洗各孔5次,然后*吸出內(nèi)容物。或者,可以使用自動(dòng)微孔板洗板機(jī)。

7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。

8. 用封板覆膜覆蓋微孔板,同時(shí)用鋁箔覆蓋,避免暴露于光照下。平板在室溫下孵育20 min。

9. 取下鋁箔和封板膜。向各孔中加入100µL ELISA終止液。輕輕混合。

10. 在酶標(biāo)儀中讀取450/650 nm下10 min內(nèi)的吸光度

 

程序注釋

1. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和未知樣品重復(fù)測(cè)定兩次。每份重復(fù)樣本的平均吸光度讀數(shù)應(yīng)用于數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化和結(jié)果計(jì)算。

2. 將光敏試劑保存在原始琥珀色瓶中。

3. 將任何未使用的抗體包被條儲(chǔ)存在含有干燥劑的箔拉鏈袋中,以防止受潮。

4. 為確保試驗(yàn)的重現(xiàn)性,必須采用仔細(xì)的技術(shù)并使用適當(dāng)校準(zhǔn)的移液裝置。

5. 除本說(shuō)明書中規(guī)定的孵育時(shí)間或溫度外,其他孵育時(shí)間或溫度可能影響結(jié)果。

6. 避免微孔中出現(xiàn)氣泡,因?yàn)檫@可能導(dǎo)致結(jié)合效率較低和重復(fù)讀數(shù)的CV%較高

7. 所有試劑在使用前應(yīng)輕輕充分混勻。避免起泡。

 

結(jié)果判讀

1. 計(jì)算每對(duì)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的平均吸光度。

2. 從所有其他讀數(shù)的平均吸光度中減去STD 1(0 ng/mL)的平均吸光度,得到校正吸光度。

3. 通過(guò)所有標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。還可使用適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)輔助數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化程序進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

 

使用各自的校正吸光度,直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取對(duì)照品和患者樣本的人完整FGF-21濃度。

 

示例數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

顯示了人完整成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF-21)ELISA檢測(cè)試劑盒的典型吸光度數(shù)據(jù)和所得標(biāo)準(zhǔn)曲線。不得使用該曲線代替每次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線運(yùn)行。

 

孔I.D.

 

OD 450/650 nm吸光度

 

結(jié)果pg/mL

 

讀數(shù)

平均值

已糾正

 

 

0

pg/mL

 

0.037

0.036

 

0.037

 

0.000

 

32.5

pg/mL

0.087

0.086

0.087

0.050

 

91

pg/mL

0.172

0.169

0.170

0.133

 

255

pg/mL

0.398

0.399

0.399

0.302

 

714

pg/mL

1.067

1.069

1.068

1.031

 

2000

pg/mL

2.835

2.903

2.869

2.946

 

對(duì)照1

0.126

0.129

0.127

0.371

 

 

 

 

60.83

對(duì)照2

0.736

0.721

0.729

1.200

 

 

 

 

481.29

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

預(yù)期值

用該人完整FGF-21 ELISA測(cè)定32份正常成人血漿樣本。發(fā)現(xiàn)正常范圍小于200 pg/mL。強(qiáng)烈建議各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)正常供體EDTA血漿或血清樣本建立自己的正常范圍。

 

程序的局限性

1. 由于沒(méi)有可用于人完整FGF-21測(cè)量的金標(biāo)準(zhǔn)濃度,因此通過(guò)與高純度FGF-21標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)性確定試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品的值。

2. 對(duì)于讀數(shù)高于標(biāo)準(zhǔn)的樣本值,建議使用稀釋液重新測(cè)定樣本。

3. 血漿標(biāo)本或試劑的細(xì)菌或真菌污染,或試劑之間的交叉污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

4. 用聚酯樹脂去離子的水可能使辣根過(guò)氧化物酶失活。

 

質(zhì)量控制

為確保結(jié)果的有效性,每項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)包括具有已知人完整FGF-21水平的適當(dāng)對(duì)照。我們建議,除本試劑盒提供的檢測(cè)試劑盒外,所有檢測(cè)試劑盒還包括實(shí)驗(yàn)室自己的FGF-21對(duì)照。

 

性能特征

 

靈敏度(LoD)

通過(guò)比20次零標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定的平均值高2倍標(biāo)準(zhǔn)差的相應(yīng)OD值測(cè)定的該人完整FGF-21 ELISA的靈敏度(低)為1.7 pg/mL。

 

高劑量“鉤狀”效應(yīng)

該試驗(yàn)表明,高達(dá)20,000 pg/mL時(shí)無(wú)任何高劑量“鉤狀”效應(yīng)。

 

精密度

通過(guò)在單次測(cè)定中測(cè)量3份供體EDTA血漿樣本(重復(fù)測(cè)定16次),驗(yàn)證試驗(yàn)內(nèi)精密度。

 

 

人完整FGF-

21值(pg/mL)

 

CV (%)

63.2

5.7

171

4.2

480

5.4

 

通過(guò)在12次單獨(dú)試驗(yàn)中一式兩份測(cè)定3份對(duì)照樣品,驗(yàn)證試驗(yàn)間精密度。

 

人完整FGF-

21值(pg/mL)

 

CV (%)

69.8

6.9

181

3.0

486

1.9

 

線性

用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋2份人EDTA血漿樣本并進(jìn)行分析。以pg/mL為單位的結(jié)果如下:

 

#

 

稀釋

 

觀測(cè)值

 

預(yù)期值

 

回收率

%

 

1

 

純品

 

286

 

-

 

-

 

1:2

138

143

96

 

1:4

75

72

104

 

1:8

37.9

36

105

 

1:16

19.5

18

108

2

純品

61.8

-

-

 

1:2

32.1

30.9

104

 

1:4

15.9

15.5

103

 

1:8

7.2

7.7

94

 

加標(biāo)回收率

向兩份患者樣本中加標(biāo)不同量的人完整FGF-21(1 vol. + 1 vol.)?;旌衔铮┎y(cè)定。結(jié)果單位為ng/mL,如下所示:

 

 

#

 

初始值

 

加標(biāo)量

 

觀察值

 

預(yù)期值

 

恢復(fù)

%

1

45.9

91

64.9

68.5

95

 

(血清)

255

150

151

100

 

 

714

388

380

102

2

40.4

91

71.2

65.7

108

 

(血漿)

255

148

148

100

 

714

406

377

108

 

 

參考文獻(xiàn)

  • Yie J等人FGF21 N端和C端在受體相互作用和活化中發(fā)揮不同的作用。FEBS Lett.2009 Jan 5;583:19-24.
  • Micanovic R等人N-和C-末端在FGF21功能活性中的不同作用。J Cell Physiol.2009 May;219(2):227-34.
  • Yusuke Murata等人FGF21作為脂質(zhì)代謝的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子:從分子進(jìn)化到生理學(xué)和病理生理學(xué)。營(yíng)養(yǎng)與代謝雜志,2011年卷,文章ID 981315,8頁(yè)

 

 

保修信息

 

Eagle Biosciences,Inc.保證其產(chǎn)品的操作或性能基本符合其隨附包裝說(shuō)明書中規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本保證明確限于退還任何缺陷產(chǎn)品的價(jià)格或使用新產(chǎn)品替換任何缺陷產(chǎn)品。本保證僅適用于買方在產(chǎn)品有效期內(nèi)向Eagle Biosciences發(fā)出書面通知的情況。此外,Eagle Biosciences沒(méi)有義務(wù)因下列原因更換產(chǎn)品:a)買方疏忽、過(guò)失或誤用,b)使用不當(dāng),c)儲(chǔ)存和處理不當(dāng),d)故意損壞,或e)不可抗力、天災(zāi)或事故。

 

Eagle Biosciences不作任何明示或暗示保證,除非本協(xié)議中另有規(guī)定,包括但不限于關(guān)于適銷性、適銷性、特定用途或用途的適用性或不侵犯任何知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保證。在任何情況下,公司均不對(duì)任何性質(zhì)的任何間接、偶然或后果性損害負(fù)責(zé),也不對(duì)任何缺陷產(chǎn)品或任何產(chǎn)品使用造成的損失或費(fèi)用負(fù)責(zé)。  未經(jīng)Eagle Biosciences,Inc.事先書面批準(zhǔn),不得轉(zhuǎn)售、修改或更改產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)售。

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