陽離子脂質(zhì)體傳統(tǒng)上用于傳遞遺傳物質(zhì),例如各種類型的DNA(pDNA,cDNA,CpG DNA,寡核苷酸,反義寡核苷酸等),各種類型的RNA(例如siRNA,mRNA等)和核酸酸模擬物(NAM)。 將DNA封裝到常規(guī)的中性帶電荷的基于PC的脂質(zhì)體中可能是一個技術(shù)問題,主要是由于質(zhì)粒的大小。由于這個問題在80年代后期,已經(jīng)開發(fā)了由陽離子脂質(zhì)和PE組成的脂質(zhì)體。這個想法是用陽離子脂質(zhì)的正電荷中和pDNA的負(fù)電荷,以便主要由于靜電相互作用有效地捕獲更多質(zhì)粒并將其傳遞到細(xì)胞中。通常,該程序僅基于將陽離子脂質(zhì)體與DNA或RNA混合并將其添加到細(xì)胞中即可。這導(dǎo)致骨料的配方。
為了設(shè)計合適的陽離子脂質(zhì)用于基因傳遞,已將兩種方法用于陽離子脂質(zhì)合成:1)基于膽固醇的設(shè)計,例如DC-膽固醇和GL-67脂質(zhì),以及2)非基于膽固醇的設(shè)計,例如作為DOTAB,DDAB和DOTMA。 為了使用脂質(zhì)體在體外成功轉(zhuǎn)移基因,應(yīng)考慮一些因素: i)結(jié)合和包裝脂質(zhì)體中DNA / RNA的能力; ii)包裝的DNA / RNA與細(xì)胞表面的相互作用; iii)DNA / RNA內(nèi)在化的效率; iv)萬一發(fā)生內(nèi)吞作用,從內(nèi)體釋放細(xì)胞內(nèi)DNA; v)細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。 已根據(jù)其在酸性條件下釋放其含量的趨勢設(shè)計了對pH敏感的脂質(zhì)體。主要概念基于病毒,該病毒通過pH 5-6的蛋白質(zhì)與內(nèi)體膜融合,并在到達(dá)溶酶體之前將其遺傳物質(zhì)傳遞到細(xì)胞質(zhì)中。 通常,pH敏感脂質(zhì)體由二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)組成。由于磷脂酰乙醇胺(PE)在酸性條件下會發(fā)生變化,因此據(jù)信它可以充當(dāng)膜融合促進(jìn)劑。 脂質(zhì)體與細(xì)胞之間相互作用的有效性高度依賴于脂質(zhì)體組合物。脂質(zhì)體通過各種內(nèi)吞過程捕獲,效率取決于細(xì)胞類型和脂質(zhì)體大小。各種大小和電荷的脂質(zhì)體可通過吞噬作用附著于巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。脂質(zhì)體附著到細(xì)胞表面后,由于早期內(nèi)體的酸性更高(6.50),內(nèi)化進(jìn)入內(nèi)體。通過成熟或囊泡融合將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到酸性更高的pH(5.5-6.0)的后一個內(nèi)體,這需要10-15分鐘。攝取后二十分鐘(或更長時間),內(nèi)含物被遞送至pH 5.0或更低的溶酶體。溶酶體是內(nèi)吞途徑中主要的降解和后的內(nèi)吞區(qū)段,pH不敏感的脂質(zhì)體在其中積累和降解。但是,在pH敏感脂質(zhì)體滲透到細(xì)胞中后,不會發(fā)生積累和降解。
有關(guān)上述脂質(zhì)體脂質(zhì)組成的更多信息,請單擊此處。
緩沖液和脂質(zhì)體大小 | 規(guī)格 |
---|---|
緩沖 | 去離子無核糖核酸水 |
pH值 | 7 |
脂質(zhì)體大小 | 100納米 |
熒光染料 | 激發(fā)/發(fā)射(nm) | 分子結(jié)構(gòu) |
---|---|---|
1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI) | 549/565 | |
3,3'-二亞油基氧雜碳菁高氯酸鹽(DiO) | 484/501 | |
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基)(銨鹽) | 460/535 | |
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(lissamine羅丹明B磺?;ㄤ@鹽) | 560/583 |
基于陽離子胺氮(在陽離子脂質(zhì)中)和DNA磷酸基團(tuán)濃度計算正負(fù)電荷之比。 DNA和RNA是核苷酸的聚合物。它們通過磷酸二酯鍵(一種特定類型的共價鍵)結(jié)合在一起,該磷酸二酯鍵可以長到數(shù)百萬個核苷酸。由于存在構(gòu)成每個核苷酸的磷酸根基團(tuán)(戊糖+含氮堿基+磷酸根),DNA和RNA帶負(fù)電。當(dāng)形成磷酸二酯鍵的一部分時,它們保留2個負(fù)電荷中的1個。失去另一個負(fù)電荷以形成與新戊糖的另一個酯鍵。這就是將該鍵稱為“磷酸二酯”的原因。例如,陽離子脂質(zhì)DOTAP具有以下結(jié)構(gòu)。
DOTAP具有一個氮,因此每個分子帶一個正電荷。1納摩爾的DOTAP可貢獻(xiàn)1納摩爾的正電荷。一些陽離子脂質(zhì)含有一個以上的氮,但并非所有的氮原子都帶有正電荷。對于其他脂質(zhì),請查看它們的分子結(jié)構(gòu)以找到分子中氮原子的數(shù)量。
RNA與DNA不同,是單鏈分子。但是,siRNA是雙鏈的。例如,在一個長21 bp的siRNA分子中,由于堿基對中有2個核苷酸,并且每個核苷酸帶有一個負(fù)電荷,因此存在42個負(fù)電荷。
1 µg DNA可產(chǎn)生3.1 nmol帶負(fù)電的磷酸鹽。
魚精蛋白是一種高度帶正電荷的聚陽離子肽,分子量為5.1 kDa,可作為DNA縮合試劑。已知魚精蛋白是精子核中用于濃縮DNA的主要成分。所有魚精蛋白都含有精氨酸,并且是強堿性的(等電點= 11-12)。
由脂質(zhì)魚精蛋白-DNA(LPD)組成的脂質(zhì)多聚體是通過魚精蛋白預(yù)壓縮的DNA與陽離子脂質(zhì)體的結(jié)合而產(chǎn)生的。這與通過陽離子脂質(zhì)和DNA之間直接靜電相互作用形成的陽離子脂質(zhì)體-DNA脂質(zhì)復(fù)合物相反。脂質(zhì)魚精蛋白-DNA具有凈正表面電荷,據(jù)信對于其與陰離子細(xì)胞表面蛋白聚糖的結(jié)合是*的。細(xì)胞表面的這種靜電相互作用觸發(fā)脂質(zhì)-DNA復(fù)合物的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。
向DNA和陽離子脂質(zhì)體中添加魚精蛋白的順序非常重要。一種方案涉及將質(zhì)粒DNA與硫酸魚精蛋白預(yù)復(fù)合,然后添加陽離子脂質(zhì)體。該協(xié)議有兩個缺點。其中之一是需要大量過量的陽離子脂質(zhì)才能實現(xiàn)大水平的基因表達(dá)。通常,陽離子脂質(zhì)/ DNA摩爾比必須大于35,才能有效體內(nèi)轉(zhuǎn)染。另一個問題是難以制備濃縮樣品。這是由于魚精蛋白硫酸鹽與質(zhì)粒DNA的強烈相互作用,這使得高濃度魚精蛋白/ DNA復(fù)合物的制備變得困難,尤其是在需要高魚精蛋白/ DNA比(w / w)的情況下。為了解決這些問題,已經(jīng)開發(fā)了第二種方案,其中將硫酸魚精蛋白與陽離子脂質(zhì)體混合,然后添加質(zhì)粒DNA。由于陽離子脂質(zhì)體和魚精蛋白之間競爭與質(zhì)粒DNA的相互作用,大大降低了魚精蛋白和DNA之間的強相互作用。在一定條件下,這將導(dǎo)致形成平均直徑小于150 nm的LPD。
為了計算正負(fù)比率,您需要考慮:
聚乙二醇化已在脂質(zhì)體學(xué)領(lǐng)域廣泛使用了數(shù)十年。聚乙二醇化的好處是*的,包括改善脂質(zhì)復(fù)合體的系統(tǒng)循環(huán)。然而,脂質(zhì)復(fù)合體的PEG化的缺點也已經(jīng)被很好地證明。這包括防止脂質(zhì)復(fù)合物與靶細(xì)胞締合以及抑制DNA從內(nèi)體區(qū)室釋放,這導(dǎo)致非常低的轉(zhuǎn)染效率。
隨著摻入陽離子脂質(zhì)體中的PEG化脂質(zhì)的分子量增加,陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性增加。例如,含有PEG5000的脂復(fù)合物比含有PEG2000的脂復(fù)合物更具細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染活性隨PEG-DSPE脂質(zhì)百分比的增加而降低。先前的研究表明,添加0.5%PEG-PE會使肺中的原始熒光素酶活性降低至原熒光素酶活性的60%,1%降低至40%,2%降低至10%。還據(jù)報道,將PEG-PE(1%的陽離子脂質(zhì))添加到新形成的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物中可以防止復(fù)合物在儲存期間聚集。但是,將含有PEG-PE的復(fù)合物在4°C下儲存會緩慢恢復(fù)其原始活性。一般來說,對于轉(zhuǎn)染實驗,不使用聚乙二醇化。但是,在某些實驗中,尤其是在體內(nèi)實驗中,使用了聚乙二醇化的脂質(zhì)復(fù)合物。
如果您需要進(jìn)行涉及陽離子脂質(zhì)體聚乙二醇化的實驗,那么強烈建議首先通過將適量的遺傳物質(zhì)添加到脂質(zhì)體中,然后在外部添加聚乙二醇化脂質(zhì)(插入后)并孵育脂質(zhì)體來形成脂質(zhì)復(fù)合物。然后將PEG脂質(zhì)在高于陽離子脂質(zhì)的液相到凝膠相轉(zhuǎn)變溫度的溫度下放置1小時(如果是不飽和陽離子脂質(zhì),例如DOTAP,則可以在室溫下孵育)。
在許多實驗中,不是使用傳統(tǒng)的PEG2000-DSPE,而是將C8-PEG2000-神經(jīng)酰胺用于脂質(zhì)體的PEG化,因為PEG-神經(jīng)酰胺是“脫落的PEG”,在與生物膜接觸時會從脂質(zhì)體中擴散出來。
由于脂質(zhì)體制劑中使用的陽離子脂質(zhì)具有細(xì)胞毒性,因此強烈建議進(jìn)行細(xì)胞生存力分析。可以通過改良的Alamar藍(lán)分析法評估細(xì)胞活力。阿拉瑪藍(lán)含有氧化還原指示劑,該指示劑在細(xì)胞代謝的氧化還原范圍內(nèi)均顯示熒光變化。簡而言之,將10μL的10%(v / v)Alamar藍(lán)色染料添加到100μL樣品中。在37ºC下孵育2小時后,在熒光分光光度計上在570 nm和600 nm上讀取所得的熒光。使用以下公式計算細(xì)胞活力(對照細(xì)胞的百分比):
PlainGenesome®是由納米級單層脂質(zhì)體制成的白色半透明液體。FluorescentGenesome®制劑帶有顏色,其顏色取決于所用熒光染料的類型(有關(guān)外觀,請參見SDS)。通常由于脂質(zhì)體小,在小瓶底部不會發(fā)生沉淀。將脂質(zhì)體包裝在琥珀色的小瓶中。
電話
QQ咨詢
4006551678