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mdbioproducts常見實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用程序的故障排除

更新時(shí)間:2021-06-28      點(diǎn)擊次數(shù):1036

 

 

mdbioproducts常見實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用程序的故障排除

 

一般實(shí)驗(yàn)室技術(shù)

洗滌技巧:

多通道移液器或噴瓶  

確保移液器的每個(gè)尖頭都正確分配或噴射瓶有足夠的壓力。清空孔中的內(nèi)容物并用指示的洗滌緩沖液體積填充孔。倒出孔,倒置并在干凈的紙巾上吸干。如插入所示重復(fù)此過程。最后一次傾析后,倒置去除任何剩余的洗滌緩沖液,并將其吸干在干凈的紙巾上。不要讓孔靜置,按照插圖中的指示進(jìn)行下一步。注意:如果在傾析時(shí)條帶變得松散,則在清洗和在干凈的水槽中潷析之前對(duì)條帶進(jìn)行編號(hào)非常有用。

歧管分配器或自動(dòng)清洗機(jī)

確保有適當(dāng)?shù)恼婵展?yīng)。檢查所有插管或插腳是否正確分配和抽吸。通過抽吸或傾析清空孔。將每個(gè)孔填充到插入物中指示的適當(dāng)體積。*吸出孔。去除緩沖液后,讓抽吸裝置留在孔中,不要過度抽吸孔。如插入物所示重復(fù)此過程,不要讓孔在最后一次抽吸后保持干燥。

移液技術(shù):

確保您使用的移液器已校準(zhǔn),并且移液器吸頭正確且牢固地固定在移液器上。將移液器設(shè)置到所需的體積并用樣品或試劑預(yù)沖洗。緩慢向上吸取試劑,使移液器緩慢返回向上位置。稍等片刻,讓試劑在吸頭中達(dá)到體積平衡。將試劑緩慢分配到第一次停止,然后輕輕分配到第二次停止。將移液器保持在此位置,直到將其從儲(chǔ)液器或孔中取出,以避免將試劑吸回。當(dāng)您取下移液器時(shí),將吸頭向上拉到容器或孔的一側(cè),以釋放可能在吸頭外側(cè)的任何液體。

 

ELISA 故障排除

許多因素會(huì)影響 ELISA 的性能。

  • 在開始之前仔細(xì)閱讀說明。這將有助于避免不必要的錯(cuò)誤。
  • 使用良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和校準(zhǔn)設(shè)備。
  • 使用干凈的容器和干凈的實(shí)驗(yàn)室空間,并在每種試劑之間更換移液器吸頭。
  • 重復(fù)運(yùn)行所有標(biāo)準(zhǔn)和樣品,因?yàn)檫@將提高準(zhǔn)確性。

精度差:

  • 清洗不*:確保儀器工作正常,并且抽吸后孔看起來是干的。
  • 試劑混合不均:確保試劑充分混合。
  • 污染:確保使用干凈的容器并在每種試劑之間更換移液器吸頭。
  • 移液錯(cuò)誤:使用良好的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)并確保正確校準(zhǔn)移液器。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:

  • 標(biāo)準(zhǔn)品制備不當(dāng):確保正確配制標(biāo)準(zhǔn)品并遵守稀釋說明。
  • 清洗不*:確保儀器工作正常,并且抽吸后孔看起來是干的。
  • 添加到孔中的體積不等:檢查移液器是否已校準(zhǔn)以及移液器吸頭是否正確就位。
  • 確保從凈 OD 中減去空白和 NSB 值。

高背景:

  • 確保正確洗滌板?;仡櫳厦娴南礈旒夹g(shù)。
  • 遵守所有孵化時(shí)間和溫度。高背景可能是由于孵育時(shí)間過長或在高于推薦溫度的情況下孵育造成的。

 漂移

  • 使用前將所有試劑置于室溫。
  • 在運(yùn)行檢測(cè)之前或按照試劑盒說明書中的指示準(zhǔn)備試劑。
  • 避免中斷檢測(cè)設(shè)置。

邊緣效果

  • 在環(huán)境條件下孵育板時(shí),請(qǐng)注意溫度變化或通風(fēng)區(qū)域。將印版放在空調(diào)或暖氣通風(fēng)口下可能會(huì)導(dǎo)致顏色不均勻。

色彩發(fā)展

  • 確保所有試劑以正確的體積和正確的時(shí)間添加到檢測(cè)中。堅(jiān)持正確的孵化時(shí)間。
  • 除非試劑盒插頁中另有說明,否則在加入終止溶液后立即讀取板。
  • 底物是否正確準(zhǔn)備和添加
數(shù)據(jù)縮減
  • 如需有關(guān)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的幫助,

IHC 故障排除

 無染色

問題 可能的解決方案)
一抗和二抗可能不匹配。 建議二抗針對(duì)產(chǎn)生一抗的物種(例如,如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的,則使用抗小鼠二抗)。
該抗體可能不適用于以天然(非變性)形式顯示蛋白質(zhì)的 IHC 程序。 在非變性和變性蛋白質(zhì)印跡上測(cè)試抗體,以確??贵w識(shí)別非變性抗原。
二抗未避光保存。 建議避免將二抗暴露在光線下。
沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。 減少抗體稀釋。
在 4°C 下孵育更長時(shí)間。
感興趣的蛋白質(zhì)并不大量存在于組織中。 運(yùn)行陽性對(duì)照。
利用放大步驟可以幫助放大信號(hào)。 
使用較低稀釋度的一抗。
目標(biāo)蛋白是核蛋白,抗體不能穿透細(xì)胞核。 為了促進(jìn)細(xì)胞核的滲透,在封閉緩沖液和抗體稀釋緩沖液中加入透化劑。
脫蠟可能不夠 將切片脫蠟時(shí)間更長。
使用新鮮制備的二甲苯。
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑可能會(huì)改變抗體識(shí)別的表位。 使用抗原修復(fù)方法揭露表位。
修復(fù)時(shí)間更短。
PBS 緩沖液可能被細(xì)菌污染,這些細(xì)菌已經(jīng)破壞了目標(biāo)蛋白質(zhì)。 在 PBS 抗體儲(chǔ)存緩沖液中使用防腐劑,如 0.01% 疊氮化物。
使用新鮮的無菌 PBS。

 高背景

問題 可能的解決方案)
非特異性結(jié)合的阻斷可能是不夠的。 將切片的封閉潛伏期延長至 30 分鐘,將細(xì)胞培養(yǎng)延長至 1 小時(shí)。使用封閉劑,例如 10% 正常血清用于切片,1-5% BSA 用于細(xì)胞培養(yǎng)。
一抗?jié)舛瓤赡芴摺?/td> 將抗體滴定至更佳濃度,使用更多稀釋液孵育更長時(shí)間。這將提供更慢但更具體的綁定。
二抗可能非特異性結(jié)合。 在沒有一抗的情況下運(yùn)行二級(jí)對(duì)照。
孵化溫度可能太高。 在 4°C 下孵育組織切片或細(xì)胞。
組織未充分洗滌。 在所有步驟之間用 PBS *清洗
內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。 使用酶抑制劑,如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑太強(qiáng),可能已經(jīng)改變了抗體識(shí)別的表位。 改變抗原修復(fù)方法。
減少抗原暴露溶液的孵育時(shí)間。
應(yīng)用了過多的基材。 減少底物孵育時(shí)間。
色原與細(xì)胞中存在的 PBS 發(fā)生反應(yīng)。 在與底物一起孵育之前,使用 Tris 緩沖液清洗切片。
透化已經(jīng)損壞了膜并去除了膜蛋白。 從緩沖液中去除通透劑。

 

非特異性染色

問題 可能的解決方案)
一抗或二抗的濃度可能太高。嘗試降低抗體濃度和/或潛伏期。 將信號(hào)強(qiáng)度與不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞進(jìn)行比較。
一抗是針對(duì)與染色組織相同的物種產(chǎn)生的(例如在大鼠組織上測(cè)試的大鼠一抗)。 當(dāng)應(yīng)用二抗時(shí),它會(huì)與所有組織結(jié)合,因?yàn)樗彩轻槍?duì)該物種產(chǎn)生的。使用針對(duì)與您的組織不同的物種產(chǎn)生的一抗/二抗。
內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。 使用酶抑制劑,如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
切片/細(xì)胞已變干。 將組織切片和細(xì)胞保持在高濕度下,不要讓它們變干。
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