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biontex轉(zhuǎn)染常見問題解答
先天免疫系統(tǒng)能夠檢測所謂的“病原體相關(guān)分子模式”（PAMP）。這些包括例如細胞外源核酸。取決于細胞類型的“先天免疫系統(tǒng)”有多明顯，它啟動針對假定病原體的防御措施的能力也越大。這導致了K2® 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和后來的K4® 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的開發(fā)。
使用化學轉(zhuǎn)染方法，特定細胞類型進行內(nèi)吞作用和增殖的能力發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因為脂質(zhì)復合物/復合物最初通過內(nèi)吞作用逃逸到細胞質(zhì)中，然后從內(nèi)體中釋放出來。如果在分裂過程中核膜在短時間內(nèi)是可滲透的，則脂質(zhì)復合物/復合物或解復合的 DNA 只能滲透到細胞核（即克服“核屏障”）。如果這兩個過程中的一個以不完善的形式發(fā)生，即使轉(zhuǎn)染方法的應用是最佳的，也可能相應地降低轉(zhuǎn)染效率。因此，低增殖或無增殖的細胞（如原代細胞或神經(jīng)細胞）或內(nèi)吞活性低的細胞（如 Jurkat 細胞）被認為難以轉(zhuǎn)染也就不足為奇了。另一個關(guān)鍵因素是先天免疫系統(tǒng)，它針對每種細胞類型的發(fā)展各不相同。細胞能夠檢測外來核酸并進入防御狀態(tài)。具有低發(fā)育先天免疫系統(tǒng)的細胞（例如 HEK293 細胞）因此易于轉(zhuǎn)染，而具有強發(fā)育免疫系統(tǒng)的細胞（例如 Jurkat 細胞）則難以轉(zhuǎn)染。
一個加劇的因素是，上面給出的這些現(xiàn)象可能不僅在細胞類型與細胞類型之間*不同，而且在同一細胞類型的不同基因型之間也可能*不同。不同大學甚至同一機構(gòu)內(nèi)不同工作組的同名細胞中可能會出現(xiàn)不同的行為，也可以在細胞系的長期傳代過程中觀察到。這種復雜性將協(xié)議參數(shù)從一個用戶傳輸?shù)搅硪粋€用戶的選項減少到最小，即使顯然涉及相同的細胞類型。
不; 每個轉(zhuǎn)染試劑都有一組特定的屬性，包括：
大腸桿菌的特定組成和比例
每個分子的特定凈載量和 pH 值
聚集體穩(wěn)定性/脂質(zhì)復合物穩(wěn)定性
這些不同的特性對它們與 DNA 和所討論的細胞類型的相互作用有直接和特定的影響。因此，協(xié)議參數(shù)不能從一種試劑轉(zhuǎn)移到另一種試劑。
不，這是不可能的。每種細胞類型和每種轉(zhuǎn)染試劑的高度特異性特性之間的相互作用非常復雜，以致于對轉(zhuǎn)染效率的預測是徒勞的。另一方面，經(jīng)驗值表明，例如靜止細胞、懸浮細胞和原代細胞通常難以轉(zhuǎn)染。但沒有規(guī)則無一??例外。
用合成載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染 DNA 的一個基本原則是，這種材料只能在細胞分裂過程中穿透“核屏障”。作為不可避免的結(jié)果，必須遵守以下幾個方面：
細胞培養(yǎng)傳代數(shù)不應超過 30 次。每次傳代都會發(fā)生一定的遺傳分化；這意味著最能抵抗傳代壓力的細胞將不成比例地增殖。此外，細胞培養(yǎng)基的成分會改變細胞的生理狀態(tài)，因為細胞會根據(jù)現(xiàn)有的營養(yǎng)條件調(diào)整自身。這導致與原始細胞的遺傳差異逐漸擴大。
轉(zhuǎn)染時細胞應盡可能快地生長。細胞應保持在高增殖狀態(tài)，稱為對數(shù)期或指數(shù)期。通過選擇適合快速增殖的培養(yǎng)基并為要使用的細胞類型和適當?shù)母袷絼?chuàng)建生長曲線，從而為接種和生長持續(xù)時間設置最佳細胞數(shù)量，可以最容易地實現(xiàn)這一階段。由于生長抑制，定期保持在匯合條件下的細胞只有在經(jīng)過幾次傳代后才能恢復其全部生長潛力。
光學匯合與實際匯合不同。上面的生長曲線表示目視確定的匯合（覆蓋整個生長表面）對應于實際匯合（生長曲線的第 5 階段）的程度。這兩個匯合值通常有顯著差異。以圖中所示的 COS7 細胞為例，很明顯，在最常見的情況下，僅實現(xiàn)了早期生長期 3。出于這個原因，如果要在貼壁細胞上執(zhí)行該過程，作為規(guī)則，細胞在轉(zhuǎn)染當天應具有約 90% 的視覺確定的匯合度。
脂質(zhì)復合物的形態(tài)一方面與陽離子脂質(zhì)的類型和所用轉(zhuǎn)染試劑的脂質(zhì)組成密切相關(guān)，另一方面與遺傳物質(zhì)與轉(zhuǎn)染試劑的比例密切相關(guān)。每種細胞類型都顯示出特定的轉(zhuǎn)染能力，具體取決于產(chǎn)生的脂質(zhì)復合物形態(tài)
。可以通過應用優(yōu)化過程確定以下最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)：
首先必須確定 DNA/RNA 與脂質(zhì)的最佳比例。通常認為，脂質(zhì)復合物需要凈正電荷才能與帶負電荷的細胞膜表面靜電相互作用，以實現(xiàn)成功的內(nèi)吞吸收。在大多數(shù)情況下，這個比例大約為 1-7µl 脂質(zhì)對 1µg DNA/RNA。
第二個關(guān)鍵因素是每個細胞的 lipoplex 量；如果這太高，產(chǎn)生的毒性會過度補償轉(zhuǎn)染的成功。因此應改變脂質(zhì)復合物的量以反映已知的 DNA/RNA 與脂質(zhì)的最佳比例。
陽離子脂質(zhì)能夠擴散到細胞膜中并使其不穩(wěn)定。隨著脂質(zhì)復合物中脂質(zhì)含量的增加，這可能是毒性增加的主要原因。出于這個原因，與 DNA/RNA 量相關(guān)的高水平脂質(zhì)只能在有限的范圍內(nèi)使用。
由于未知的原因，脂質(zhì)復合物對細胞的毒性影響比轉(zhuǎn)染試劑本身要大得多。
必須假設先天免疫系統(tǒng)在檢測到細胞內(nèi)的外來核酸后觸發(fā)細胞凋亡，這很難與毒性相區(qū)分。
這導致了第二個限制：過多的 lipoplex 水平會損害轉(zhuǎn)染成功。毒性的另一個原因可能是通過表達或抑制的蛋白質(zhì)本身進行所需的細胞操作，這可能對細胞生理學產(chǎn)生重大影響。在這種情況下，最佳轉(zhuǎn)染可能會導致高細胞死亡率，這只能通過下調(diào)轉(zhuǎn)染效率來避免。
細胞培養(yǎng)中使用的血清（例如 FCS、FBS）是一種高度復雜的不確定混合物，由水溶性血液成分（如生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)）組成，并且總是對轉(zhuǎn)染成功有重大影響。
血清具有廣泛的脂質(zhì)復合物抑制特性。因此，在脂質(zhì)復合物形成（結(jié)合轉(zhuǎn)染試劑和遺傳物質(zhì)）期間不得存在血清。
用這些轉(zhuǎn)染試劑形成的脂質(zhì)復合物可以與含血清的細胞培養(yǎng)基一起添加到細胞中，而不會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。事實上，當存在血清時，這些試劑會定期提供更高水平的轉(zhuǎn)染效率。
血清支持細胞生長行為。其成分，如生長激素，可顯著促進待轉(zhuǎn)染細胞的生長和細胞分裂率，從而顯著提高轉(zhuǎn)染效率。在選擇合適的細胞培養(yǎng)基時，還應考慮細胞的增殖行為。如果存在多種可能性，則應選擇細胞增殖率最高的培養(yǎng)基。
由于血清的保質(zhì)期極其有限（最長 1 個月），應注意所用血清在有效期內(nèi)，因為使用過期血清會顯著損害細胞所需的成分。在這種情況下，細胞顯示出*不同和減少的生長模式（見圖），并且無法再預期最佳轉(zhuǎn)染結(jié)果。
血清的質(zhì)量可能因批次而異。如果所有其他參數(shù)保持不變，成分的多樣性會導致不同的轉(zhuǎn)染結(jié)果。
是的，因為細胞培養(yǎng)物的任何污染，無論是真菌、病毒還是細菌，都會對轉(zhuǎn)染結(jié)果產(chǎn)生重大影響，通常會導致整個細胞培養(yǎng)物死亡。由于支原體污染具有不可見且不會導致細胞死亡的特殊特性，因此污染可能會在很長一段時間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)。然而，這些細菌對轉(zhuǎn)染成功有廣泛的影響：
由于精氨酸需求增加，細胞生長顯著降低（見圖）
支原體被先天免疫系統(tǒng)識別并調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生
支原體引起染色體畸變
支原體滯留在細胞膜中并可能調(diào)節(jié)細胞膜過程，如內(nèi)吞作用。
有和無支原體污染的 HeLa 細胞的不同細胞生長：
支原體污染對轉(zhuǎn)染效率的影響：
在 48 孔板上用 pCMVßgal 轉(zhuǎn)染 HeLa 和 HepG2 細胞。通過 ONPG 和 BCA 分析評估比吸收值。下圖顯示了支原體污染對 HeLa 和 HepG2 細胞的廣泛影響（未污染細胞效率的 17% 和 5.6%）：
支原體可以在幾乎所有已知的細胞類型中增殖，因此無處不在。據(jù)估計，大約 80% 的日本細胞培養(yǎng)物、65% 的阿根廷細胞培養(yǎng)物和 15% 的美國細胞培養(yǎng)物被支原體污染。主要來源是實驗室工作人員以及胰蛋白酶和血清，它們是從動物來源分離的細胞培養(yǎng)添加劑。
一種長期存在的支原體檢測方法是 DAPI 染色。然而，由于其極低的檢測靈敏度，該方法僅顯示出顯著水平的污染。PCR 方法明顯更靈敏，因此是檢測方法。Biontex 提供基于 PCR 的檢測試劑盒MycoSPY®和MycoSPY® Master Mix，它們甚至可以識別支原體基因組的單個拷貝。如果細胞培養(yǎng)物受到污染，我們建議使用MycoRAZOR®進行處理。
基本上，具有更高純度的遺傳材料將始終提供更好的轉(zhuǎn)染結(jié)果。需要特別注意的一個因素是被稱為內(nèi)毒素的脂多糖污染。它們在制造過程中由細菌引入，即使以微量存在，也會被先天免疫系統(tǒng)檢測到，從而顯著損害轉(zhuǎn)染過程。應注意遺傳材料的清潔包括去除內(nèi)毒素，可提供商業(yè)試劑盒。不建議將基于“小量制備方案”的質(zhì)粒清洗用于轉(zhuǎn)染目的，因為遺傳物質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)直接影響轉(zhuǎn)染成功：
由于啟動子具有特定的表達率，因此細胞具有特征量或每單位時間的表達產(chǎn)物量。
根據(jù)細胞類型，待表達基因或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特定特征可能顯著影響細胞的生理學，甚至導致細胞死亡。
遺傳物質(zhì)的尺寸和三級結(jié)構(gòu)也會影響潛在的轉(zhuǎn)染成功。一般來說，以下原則適用：
細胞的轉(zhuǎn)染能力隨遺傳物質(zhì)的量而下降
超螺旋質(zhì)粒在瞬時轉(zhuǎn)染中更有效，而線性 DNA 更適合于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
Lipoplexes 粘附在細胞培養(yǎng)容器的自由塑料表面上，因此在轉(zhuǎn)染過程中丟失。這就是為什么不能簡單地將針對特定容器格式確定的最佳參數(shù)與其他容器格式成比例地應用的原因。
使用的容器規(guī)格越小，lipoplex 的量/mm² 就必須越高。當從 6 孔培養(yǎng)皿縮小到 96 孔格式時，必須使用大約三倍于 lipoplex / cm² 的量才能實現(xiàn)可比的轉(zhuǎn)染效率。
不。鑒于常見問題解答中給出的大量參數(shù)是成功轉(zhuǎn)染的影響因素，很明顯，提供通用的特定協(xié)議是徒勞的。我們網(wǎng)站上列出的已發(fā)表案例研究只能說明如何盡快實現(xiàn)成功轉(zhuǎn)染，一般不能聲稱具有普遍適用性。最后可能需要在自己的實驗室環(huán)境中進行優(yōu)化。
在室溫或 4°C 下長期儲存期間，脂質(zhì)體制劑往往會凝結(jié)。這意味著大小分布向更大的脂質(zhì)體移動，這可能對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生負面影響。冷凍和解凍脂質(zhì)是一種已知的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，因此也可用于為某些轉(zhuǎn)染試劑重建理想的脂質(zhì)體大小分布。
為此目的，該試劑在冰箱中冷凍，然后在室溫下解凍。軟渦旋后，試劑再次儲存在 4°C。建議在使用 METAFECTENE 轉(zhuǎn)染試劑系列（METAFECTENE®、METAFECTENE® PRO、METAFECTENE® SI）和K2® 轉(zhuǎn)染試劑/ K4® 轉(zhuǎn)染試劑，兩個月后。
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