人：HeLa 報告細(xì)胞系（包括 I-Sce1 轉(zhuǎn)染）

SKU：DR3000-HRHeLa-Sce

分類：細(xì)胞背景 DNA 修復(fù),同源重組報告細(xì)胞 標(biāo)簽：DNA 修復(fù),同源重組, HR DNA 報告基因

用于詢問同源修復(fù) (HR) 通路（I-Sce1 轉(zhuǎn)染）的基于細(xì)胞的篩選試劑盒

動物細(xì)胞中的 DNA 修復(fù)途徑可分為兩大類：HR 和 NHEJ。HR 或同源重組是次要途徑，但在保護(hù)細(xì)胞免受基因毒性方面非常重要。HR 需要同源序列并且僅限于 S 期。基于特定報告基因的 HR 分析對于抗癌藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目非常有益，可以更多地了解 DNA HR 修復(fù)過程以及建立交叉通路和可藥物通路靶點(diǎn)。

這是一款基于 HeLa 細(xì)胞的報告試劑盒，旨在讓客戶篩選或識別影響或影響 HR DNA 修復(fù)過程的試劑（藥物、天然產(chǎn)物、小分子、合成物、miRNA 和基因）。該試劑盒使用 GFP 作為HR 通路的原位讀數(shù)。

DNA 不斷暴露于基因毒劑，導(dǎo)致基因表達(dá)、一級序列、易位等發(fā)生變化，所有這些都是疾病的先兆。在各種形式的 DNA 損傷中，最危險的是 DNA 雙鏈斷裂 (DSB)，這主要是由于失去野生型序列以恢復(fù)基因組完整性。為了應(yīng)對 DSB 帶來的威脅，細(xì)胞已經(jīng)開發(fā)出多種機(jī)制來檢測、發(fā)出信號并修復(fù) DNA。

兩條主要途徑，同源重組 (HR) 和非同源末端連接 (NHEJ)，參與 DSB 的修復(fù)。這些途徑可以進(jìn)一步細(xì)分為特定的子途徑過程。這些途徑在很大程度上彼此不同，并且以互補(bǔ)的方式發(fā)揮作用。雖然 NHEJ 不依賴于細(xì)胞周期，但 HR 強(qiáng)烈依賴于 S 期。NHEJ 涉及沒有同源性的兩個 DNA 末端的連接，并且往往容易出錯，而 HR 具有高保真度并且基本上沒有錯誤。在 HR（有時稱為基因轉(zhuǎn)換）中，與 DSB 兩側(cè)具有同源性的供體 DNA 序列提供遺傳信息以修復(fù)斷裂。同源序列被復(fù)制到斷裂的基因座中，使修復(fù)的基因座成為供體序列的精確副本，而不改變供體序列（圖 1）。

設(shè)計了一個基于細(xì)胞/細(xì)胞環(huán)境的系統(tǒng)，以允許研究人員檢查和詢問活 HeLa 細(xì)胞中的 HR 過程。HR 試劑盒使用雙 GFP 盒，通過同源重組 (HR) 將 GFP 陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 GFP 陽性細(xì)胞。由于野生型（同源）GFP 片段存在于 DNA 斷裂附近，因此將通過 HR（作為基因轉(zhuǎn)換）進(jìn)行 DNA 修復(fù)。為了引入精確的 DNA 切割，巨型核酸內(nèi)切酶 (I-Sce1) 在 Cassette 1 的 GFP 基因座中引入 DS 斷裂（圖 1）。值得注意的是，人類基因組不包含 I-Sce1 位點(diǎn)。因此，Cassette 1 中的 I-Sce1 位點(diǎn)意味著 DS 斷裂僅發(fā)生在該精確位置，而不發(fā)生在基因組的其他位置。DS 斷裂啟動 HR，并使用 WT 序列作為同源模板（位于盒 2 中），基因轉(zhuǎn)化為 WT，出現(xiàn) GFP 陽性細(xì)胞（圖 2）。HR 由 DS 斷裂觸發(fā)，這是通過用 I-Sce1 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的（圖 2）。該技術(shù)適用于活細(xì)胞成像（通過跟蹤單個 GFP+ 細(xì)胞）。實(shí)時成像為這些細(xì)胞中的 HR 分析提供了基本的單細(xì)胞分辨率。此外，可以追蹤 DNA 修復(fù)的后代，因?yàn)檫@些細(xì)胞也是 GFP 陽性的。有關(guān)實(shí)時成像的更多詳細(xì)信息，請參閱下面的視頻。實(shí)時成像為這些細(xì)胞中的 HR 分析提供了基本的單細(xì)胞分辨率。此外，可以追蹤 DNA 修復(fù)的后代，因?yàn)檫@些細(xì)胞也是 GFP 陽性的。有關(guān)實(shí)時成像的更多詳細(xì)信息，請參閱下面的視頻。實(shí)時成像為這些細(xì)胞中的 HR 分析提供了基本的單細(xì)胞分辨率。此外，可以追蹤 DNA 修復(fù)的后代，因?yàn)檫@些細(xì)胞也是 GFP 陽性的。

細(xì)胞背景 DNA 修復(fù)

1. HR-HeLa 細(xì)胞準(zhǔn)備在 T-25 瓶中培養(yǎng)或作為冷凍細(xì)胞沉淀（客戶可以要求）。我們向希望儲存細(xì)胞以備將來使用的客戶提供冷凍細(xì)胞。我們還可以將活細(xì)胞發(fā)送給希望立即開始使用該生產(chǎn)線的客戶。

2. I-Sce1 基因表達(dá)質(zhì)粒。

3. 詳細(xì)的協(xié)議描述了如何設(shè)置和使用該試劑盒來檢測所提供的細(xì)胞宿主中的 HR 機(jī)制。