GMP資質(zhì)級別轉(zhuǎn)染試劑——現(xiàn)貨,
GMP資質(zhì)級別轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染效率高,按照符合GMP認證管理體系下,采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn),所用起始材料及所需化學品和配制過程均在無菌環(huán)境中操作進行,以確保制造過程中每個步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。
78EF10003-1L | 1L | 詢價 |
78EF10003-5ml | 5ml | 詢價 |
基本信息 BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉(zhuǎn)染試劑,本制品利用BIOHUB公司生產(chǎn)的線性陽離子聚合物,按照符合GMP認證管理體系下,采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn),所用起始材料及所需化學品和配制過程均在無菌環(huán)境中操作進行,以確保制造過程中每個步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴格控制重金屬殘留、細菌內(nèi)毒素殘留等,生產(chǎn)工藝符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程,保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
PH值檢測通過中國藥典 2020 版第四部 pH 值測定法(通則 0631)
檢測遵循《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。
檢測遵循USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
細菌內(nèi)毒素檢測符合中國藥典2015版四部通則(1143)方法2光度測試法(動態(tài)濁度法)
重金屬殘留檢測符合國藥典 2020 版第四部重金屬檢查法(通則 0821)
支原體檢測 使用支原體檢測試劑盒
質(zhì)量信息表
產(chǎn)品特點 BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數(shù)表達系統(tǒng)中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩(wěn)定的高表 達(96 孔板至 100L 生物反應器)?,F(xiàn)在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進行細胞轉(zhuǎn)染.。
GMP級別定制監(jiān)管,支持并滿足合規(guī)要求。
不含動物源性成分。
嚴格遵循以下規(guī)范生產(chǎn) 1. ISO 9001:2015, certified facility。
嚴格按照《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。
從工藝開發(fā)到臨床試驗和商業(yè)化的無縫過渡生產(chǎn)細胞系(HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chǎn)量。
操作方法參考
一、貼壁細胞轉(zhuǎn)染 以 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細胞為例:
(一)轉(zhuǎn)染前準備
1) 轉(zhuǎn)染前一天:用膠原酶 (WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化細胞并計數(shù)(不建議用胰酶)。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS *培養(yǎng)基和 1ml 的細胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養(yǎng) 箱培養(yǎng) 24h。
2) 24h 后,移除之前培養(yǎng)基,每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。注意:確保 293T 細胞生長狀態(tài)良好傳代 不超過 15 代。
(二)轉(zhuǎn)染過程
3) 第一天:顯微鏡下檢查細胞匯合度, 當細胞達到 70%到 80%的匯合度時,開始準備轉(zhuǎn)染。
4) 對于每孔細胞,用 100µl 無血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml(DNA/總培養(yǎng)體積)。
5) 對于每孔細胞,用 100μL 無血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP 的比例要依據(jù)自己實驗摸索最適比例。
6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中(總體積 200µL)輕輕混勻, 室溫孵育 30 分鐘。
7) 小心地將 BIOHUB-PRO GMP復合物滴加到細胞培養(yǎng)板每個孔中,輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入,而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。
8) 將培養(yǎng)板放入 37°C,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。
(三)觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果
9) 第二天:在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率,通常超過 80%的 293T 細胞在轉(zhuǎn)染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉(zhuǎn)染時應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進行優(yōu)化,以達到最適比例, 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI,用BIOHUB-PRO GMP時應適當 降低使用濃度。
通常情況下,分別準備BIOHUB-PRO GMP GMP和 DNA 轉(zhuǎn)染溶液時其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細胞培 養(yǎng)液體積總量的 1/10-1/20,如細胞培養(yǎng)液體積為 3ml,則稀釋BIOHUB-PRO GMPI及 DNA 的體積為150ul。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml(DNA 質(zhì)量/細胞培養(yǎng)總體積)[1][4]。 不同質(zhì)粒種類以及大小會影響轉(zhuǎn)染效率,如較大片段插入質(zhì)粒可能轉(zhuǎn)染效率低,可根據(jù) 實際實驗需要調(diào)整,如適當增加轉(zhuǎn)染質(zhì)??偭康?。 ?HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打,但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞,如果表達的是膜蛋白,胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達, 建議用膠原酶消化細胞,我們推薦用(LS004196,WORTHINGTONG)的膠原酶。 對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養(yǎng)基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例,就可以在轉(zhuǎn)染后 24 至 96 小時內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率,以優(yōu)化最大表達量時間點。
二、懸浮細胞轉(zhuǎn)染
離心對數(shù)期生長的細胞用新鮮的培養(yǎng)基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規(guī)模轉(zhuǎn) 染時,如需大規(guī)模轉(zhuǎn)染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL,可參考文獻[4]。以 293F 細胞 于 100mL 培養(yǎng)瓶(溶液體積占瓶體積的 1/5)操作體系舉例如下:(一)轉(zhuǎn)染前準備 1) HEK293F 細胞傳代接種于 20mL 懸浮細胞生長培養(yǎng)基中(36.5℃,120rpm,5%CO2 )的條 件下培養(yǎng)。當細胞密度到 1X10 6cells/mL,然后旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng),2~4 小時 后可以進行轉(zhuǎn)染。(二)轉(zhuǎn)染過程 2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適量的 DNA,使 DNA 終濃度為 1ug/ml(DNA/總 培養(yǎng)體積)。混勻并靜置 5min。 3) 用1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP,混勻并靜置 10min。(78BioPEI:DNA 參考比例范圍,可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO GMP和 DNA 優(yōu)化方案優(yōu)化)。 4) 將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。 5) 將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)液中,搖勻后旋緊瓶口放回搖床 (36.5℃,5%CO2,120rpm)。 6) 基因表達可在 24-72 小時后檢測,具體時間取決于細胞系和轉(zhuǎn)基因. 小貼士:在懸浮培養(yǎng)中,單個細胞的轉(zhuǎn)染效率要高于聚集在一起的細胞,需要優(yōu)化適合單細胞的 生長條件。 方形瓶應經(jīng)過兩個連續(xù)的干燥循環(huán)高壓滅菌(每個 45 分鐘,干燥 15 分鐘) 蓋子應盡可能松,不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前,將其*放入層流罩中。如 果瓶子向內(nèi)塌陷,細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產(chǎn)量,有參考文獻表明轉(zhuǎn)染后 24 小時,可以適當稀釋細胞,稀 釋比例參考范圍(1:2—1:5)之間,可以增加蛋白產(chǎn)量,稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據(jù)經(jīng)驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO GMP 轉(zhuǎn)染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉(zhuǎn)染,但必須經(jīng)過上述 特定流程的 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例和用量的相應優(yōu)化。
注意事項
不同質(zhì)粒種類以及大小會影響轉(zhuǎn)染效率,可如較大片段插入質(zhì)粒可能轉(zhuǎn)染效率低,可根據(jù)實際實驗需要調(diào)整,如適當增加轉(zhuǎn)染質(zhì)??偭康?。
細胞狀態(tài)及代數(shù)會較大程度影響轉(zhuǎn)染。剛復蘇細胞需傳代2-3次以上,待細胞生長穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染實驗。為保證實驗穩(wěn)定性,轉(zhuǎn)染細胞盡量選擇20代以內(nèi)進行實驗。
對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。
初次使用應優(yōu)化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例, 通常推薦是1:2-1:3,通過調(diào)整DNA/BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑比例優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率,調(diào)整范圍DNA(μg):BIOHUB-PRO GMP(μL) 比值在1:0.5-1:5。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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