G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素 說明書

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產(chǎn)品貨號(hào)

基本信息

產(chǎn)品簡介

        G418 Sulfate（G418硫酸鹽），也稱作Geneticin（遺傳霉素），是一種結(jié)構(gòu)類似于慶大霉素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素，通過影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來干擾蛋白合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、高等植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。其抗性基因（主要為neo基因）位于轉(zhuǎn)座子Tn601（903）或Tn5（來源于細(xì)菌），但是可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。通過基因重組技術(shù)將這些抗性基因?qū)爰?xì)胞，使其獲得對(duì)G418的耐藥性，從而用來篩選和維持培養(yǎng)攜帶抗性基因的原核或者真核細(xì)胞。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后，使其編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3')II）。此酶通過共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn)，需要建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）確定殺死無抗性細(xì)胞的zui低有效濃度。 植物細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉素和巴龍霉素。

使用說明

1. G418儲(chǔ)存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）

    （1）活力單位的換算

根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A₀）×A₁=A₂，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A₁是想配制的活性G418濃度。A₂是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為：750 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取663.3 mg粉末。

（2）除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其wan全溶解。

先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。

 【注】

      ①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過濾，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨磜an全溶解，過濾過程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性。

      ②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲(chǔ)存液。

 2. 常用篩選濃度

 一般來說，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長條件，細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來確定最佳篩選濃度。

 通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL。

 以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

3. 殺滅曲線的建立

      【注意事項(xiàng)】為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度，可通過建立殺滅曲線來實(shí)現(xiàn)，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性zui強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。

（1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO₂培養(yǎng)過夜。

     【注】對(duì)于需要更高密度來檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

（2）根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

（3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

（4）接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

（5）按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

      （1）轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

    【注】細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷成效更優(yōu)。當(dāng)細(xì)胞過于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。

（2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

（3）篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染以及篩選效果。

（4）挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

（5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

運(yùn)輸與保存方法

常溫運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期3年。避免受潮，否則會(huì)降低抗生素活力。

注意事項(xiàng)

（1）本品不可高壓滅菌；

（2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性。

（3）配制G418溶液時(shí)，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液及工作液。

（4）G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細(xì)胞密度過高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

（5）即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

（6）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。