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雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(高敏型)說明書

更新時間:2023-04-06      點擊次數(shù):1161

雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(高敏型)說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司(Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.)屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司(2009年成立)旗下的子公司,成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌,打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時,把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè),共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè),圓夢中國。
產(chǎn)品詳情

貨號

規(guī)格

價格

78EA10009-100T

100T

1,440.00

產(chǎn)品描述

 報告基因檢測常用于研究真核生物基因表達調(diào)控,螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發(fā)出生物螢光(bioluminescence),這種發(fā)光反應(yīng)具有良好的光學特征和濃度線性范圍,同時檢測的靈敏度高,可達到 10-20mol。兩種催化反應(yīng)最適濃度不同,因此互不干擾,配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng),其中海腎螢光素酶常作為內(nèi)參照。

  螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kDa 的蛋白,在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin,在此過程中會產(chǎn)生發(fā)射波長 560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為36 kDa的蛋白,在氧氣存在條件下,催化腔腸素(Coelenterazine) 氧化成 coelenteramide,在此過程中會發(fā)出波長約為 480 nm 的生物螢光。在后加入海腎螢光素酶底物時,可有效淬滅螢火蟲熒光素酶催化 luciferin 的發(fā)光,而不干擾海腎螢光素酶的活性,從而實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。生物螢光可以通過化學發(fā)光儀(luminometer)或多功能酶標儀進行測定。通過螢光素酶與其底物催化發(fā)光的體系,可以高效、靈敏地檢測目的基因的表達。

image.png 

產(chǎn)品組分

名稱

規(guī)格

保存條件

5x Universal lysis BufferULB

20 mL

-20℃

Fluc Buffer A

5 mL

-20℃

Fluc substrate

干粉

-20℃

Rluc Buffer B

5 mL

-20℃

50x Rluc substrate

100 μL

-20℃

使用方法

使用方法

1. 試劑準備:

11x Universal lysis Buffer 配置:取所需體積的 5x Universal lysis Buffer 臨用前用三蒸水稀釋至 1x 用;

2Fluc buffer A 工作液:試劑盒啟時,將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate中,適當吹打搖勻至粉末充分溶解后分裝到棕色管中-20℃保存?zhèn)溆茫?/span>

3Rluc Buffer B 工作液:臨用前取 50x Rluc substrate  Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用(按需配置),配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內(nèi)使用有效。(試劑配置過程中注意避光)

2. 細胞裂解物制備:

棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,加入足量 PBS 清洗一遍,細胞刮刮取收集沉淀(如為懸浮細胞直接離心棄上清收集沉淀)。細胞沉淀可-80℃保存,也可立即加入適量 1x Universal lysis Buffer 吹打混勻,液氮凍融三次,制備細胞裂解物。

細胞裂解液推薦使用量:

細胞培養(yǎng)板

24孔板

12孔板

6孔板

1x Universal lysis BufferULB

40 μL

60 μL

100μL

3. 螢光數(shù)值檢測:

1)熒光酶標儀設(shè)定, 選擇生物發(fā)光檢測功能,根據(jù)本批樣本的靈敏度選擇合適增益與積 分時間,默認為增益 135,積分時間 10 s

2)檢測:

1) 移液槍吸取細胞裂解液 20 μL 到黑色孔板底部(充分混勻裂解物);

2) 加入 100 μL Fluc buffer A,移液器輕柔快速吹打混勻三次,立即啟動檢測,記錄發(fā)光值 (值);

3)加入 100 μL Rluc buffer B,移液器輕柔快速吹打混勻三次,立即啟動檢測,記錄發(fā)光值(值)。(因手動控制檢測會導致時間誤差較大,對結(jié)果有一定的影響,建議配備計時器,保證不同 樣本之間反應(yīng)和檢測時長基本一致)

4.數(shù)據(jù)分析:

1)實驗設(shè)計:根據(jù)實驗目的,每組實驗均應(yīng)設(shè)置空白對照組,對照組和處理組。

a.空白對照組

背景 F:未轉(zhuǎn)染細胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R:未轉(zhuǎn)染細胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B

注:空白對照組樣品量須與實驗樣品量相同,且與實驗樣品含有相同的培養(yǎng)基/血清組合。

b. 對照組:轉(zhuǎn)染細胞未經(jīng)實驗因素處理 (即對照組 和對照組 R)。

c. 實驗組:轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)實驗化合物處理 (即實驗組 和實驗組 R)

計算結(jié)果:對照組比值=(對照組 F-背景 F)/(對照組 R-背景 R),

實驗組比值=(實驗組 F-背景 F/(實驗組 R-背景 R)。

表達倍數(shù)=實驗組比值/對照組比值。

 

image.png 

 

 2.熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作示意圖

實驗案例分析

在六孔板中接種適量細胞過夜至貼壁狀態(tài),第二天用新鮮的空白培養(yǎng)基饑餓細胞 4h 后共轉(zhuǎn)三個質(zhì)粒:

1.含有法尼醇 受體(FXR)啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因表達載體質(zhì)粒;

2.含有 FXR 啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子 E2 功能區(qū)的表達載體質(zhì)粒;

3.海參熒光素酶重組表達載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染 6h 后更換為含有不同藥物濃度的鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acidCDCA)和奧貝膽酸(Ocaliva,OCA)和Complete culture solution培養(yǎng)細胞 48h,最后按試劑盒說明書操作刮收沉淀,隨后立即裂解進行熒光素酶報告基因活性檢測,結(jié)果如下:

 

 image.png

 3(左)兩個濃度(10μM,20 μMCDCA 藥物處理下,FXR 啟動子區(qū)熒光素酶報告基因激動倍數(shù)圖;

  ()兩個濃度10μM,20 μMOCA 藥物處理下,FXR 啟動子區(qū)熒光素酶報告基因激動倍數(shù)圖

  (紅色:起發(fā)生物品牌產(chǎn)品測定結(jié)果;黃色:進口“P"品牌產(chǎn)品測定結(jié)果。

注意事項

1)反應(yīng)溫度:酶促反應(yīng)對溫度較為敏感,加樣檢測前務(wù)必將檢測試劑以及細胞培養(yǎng)液平衡至室溫(20-25℃)。

2)檢測儀器:能檢測化學發(fā)光的儀器都適用,但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同,測得的光信號值也會不同。

    檢測板:為防止孔間干擾,推薦使用不透光酶標板。

3)發(fā)光信號會受到檢測環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響,應(yīng)確保同組內(nèi)不同樣本檢測條件一致。

4)為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套。

5)本產(chǎn)品僅作科研用途!


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