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細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書

更新時(shí)間:2023-04-11      點(diǎn)擊次數(shù):838

細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司(Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.)屬于上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司(2009年成立)旗下的子公司,成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌,打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時(shí),把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國(guó)產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個(gè)和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè),共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國(guó)生物制造企業(yè),圓夢(mèng)中國(guó)。

產(chǎn)品詳情

貨號(hào)

規(guī)格

價(jià)格

78EA10011-100T

100T

詢價(jià)

 產(chǎn)品描述

漿核蛋白的分離提取屬于生物學(xué)研究的重要實(shí)驗(yàn)之一,對(duì)于探究細(xì)胞中的不同組分以及蛋白在細(xì)胞中的定位具有重要的意義,促進(jìn)亞細(xì)胞蛋白組學(xué)發(fā)展,提取的核蛋白可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面研究,例如Pull DownEMSA,footprinting等,為分子機(jī)制深入探索提供可靠技術(shù)支持。

基本原理如下:細(xì)胞在低滲條件下胞膜會(huì)發(fā)生脹破,釋放漿蛋白,離心得到細(xì)胞核沉淀,最后利用高鹽溶液抽提得到核蛋白,本試劑盒利用該原理,優(yōu)化配方組分和提取方法提供了一種高效提取漿核蛋白的方法,較大保持蛋白的天然活性,同時(shí)漿蛋白與核蛋白之間存在極少的交叉污染,為后續(xù)研究提供可靠的樣本。本試劑盒只適用于細(xì)胞樣品的核漿蛋白提取,每T約適用于約一個(gè)大皿細(xì)胞量的提取。

產(chǎn)品組成

名稱

規(guī)格

細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A

50 mL

細(xì)胞核蛋白抽提試劑B

5 mL

試劑C

0.5 mL

運(yùn)輸與保存

-20℃保存,一年有效

實(shí)驗(yàn)步驟

1.試劑準(zhǔn)備:

室溫溶解試劑盒中三種組分,溶解后混勻冰上放置備用

1)自備100 mM PMSF母液;

2)漿蛋白抽提工作液:用細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A將試劑C稀釋至1X用,臨用前加入PMSF母液使其終濃度為1mM(現(xiàn)配現(xiàn)用);

3)核蛋白抽提工作液:用細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B將試劑C稀釋至1X用,臨用前加入PMSF母液使其終濃度為1mM(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

2. 收集細(xì)胞沉淀

對(duì)于貼壁細(xì)胞:棄去原來培養(yǎng)基,PBS清洗一遍,用細(xì)胞刮或消化收集細(xì)胞沉淀,盡可能吸凈上清,留下沉淀備用(推薦使EDTA溶液代替胰酶消化,以免胰酶殘留降解目的蛋白;每個(gè)樣品可用小離心機(jī)或原來離心機(jī)進(jìn)行二次離心,充分棄去殘留上清以保證后續(xù)提取效果不受影響);對(duì)于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,PBS清洗一遍,盡可能吸凈上清,留下沉淀備用。

3. 漿蛋白的提取

1)約50 μL體積的細(xì)胞沉淀中加入200 μL細(xì)胞漿蛋白抽提工作液,反復(fù)吹打混勻十多次至沉淀散離,冰浴10 min后再次吹打混勻十多次,繼續(xù)冰浴裂解5 min。

2)高速劇烈渦旋5s4℃ 600g離心5 min,此時(shí)得到的沉淀為細(xì)胞核沉淀,上清為粗提的漿蛋白,將此上清再次4℃ 12000g離心10 min去除雜質(zhì)即得到純凈的細(xì)胞漿蛋白。

4.核蛋白的提取

1 對(duì)于步驟3-(2)中獲得的細(xì)胞核沉淀加入400 μL細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A此時(shí)使用的試劑A不含試劑C),吹打混勻十多次至沉淀分散,4℃,冰浴5 min 600 g離心5 min,棄去上清保留沉淀,得到的沉淀重復(fù)該操作一次,最后盡最大努力棄去上清保留沉淀。

2)對(duì)于步驟4-(1)中獲得的沉淀加入100 μL細(xì)胞核蛋白抽提工作液,冰浴裂解30min,期間多次渦旋振蕩10-15s以充分裂解(核蛋白裂解后,如果條件允許建議使用超聲以大功率的提取核蛋白,增加蛋白質(zhì)的溶解度,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性,超聲3次,每次5秒,功率90w)。

34℃ 12000g離心10 min收集上清為細(xì)胞核蛋白。抽提得到的漿核蛋白可立即使用,也可-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

 

實(shí)驗(yàn)案例分析

細(xì)胞刮收集A549,H1299Hela三種細(xì)胞沉淀樣品,每種細(xì)胞約一個(gè)大皿的細(xì)胞量,按照試劑盒使用說明進(jìn)行核漿蛋白的分離提取,得到的漿蛋白和核蛋白用于western blot分析,考察其核漿分離效果,結(jié)果如下圖所示:

         image.png

3.三種細(xì)胞樣品的漿核蛋白western blot分析結(jié)果

注意事項(xiàng)

1)需自備PMSF。PMSF母液用無水乙醇配制,臨用前2-3 min內(nèi)加入,以免在水溶液中很快失效;

2)所有的抽提步驟都需要在冰上或者4℃進(jìn)行;

3)本試劑盒只適用于細(xì)胞樣品漿核蛋白的提取分離,提取到的蛋白樣品可直接用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定;

4)為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套;

5)本產(chǎn)品僅作科研用途!


上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
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