簡(jiǎn)要描述:熒光金 Fluoro-Gold 熒光金逆行標(biāo)記大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 Fluorochrome Fluoro Gold 78000 熒光金試劑 Fluorochrome 授權(quán)代理,熒光金大量現(xiàn)貨
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78000 | 熒光金 Fluoro-Gold | 20mg | fluorochrome |
熒光金逆行標(biāo)記大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞
【摘要】 目的 將熒光金(flurogold,FG)注射于SD大鼠上丘,觀察到被FG逆行標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGC),以及SD大鼠RGC的數(shù)目及分布。方法 用3%FG雙上丘注射,逆行標(biāo)記RGC。5天后做視網(wǎng)膜定向鋪片,在熒光顯微鏡下距離視乳頭中心上下左右各2mm拍攝照片。利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)做RGC計(jì)數(shù)。結(jié)果 右眼RGC單位面積數(shù)量472.9±54.13,左眼RGC單位面積數(shù)量471.5±52.54。雙眼RGC單位面積數(shù)量相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。視網(wǎng)膜血管自視盤(pán)發(fā)出呈放射狀,血管走行區(qū)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞。距視盤(pán)2mm始RGC分布較致密,視網(wǎng)膜周邊部細(xì)胞分布較為稀疏。結(jié)論 用熒光金逆行標(biāo)記上丘方法來(lái)標(biāo)記RGC,是實(shí)驗(yàn)條件下研究RGC數(shù)量動(dòng)態(tài)變化的可靠、有效方法。
【關(guān)鍵詞】 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;熒光金
Retinal ganglion cells retrograde labelled by injection of fluorogold
LI Yue-hua,MA Ke,Xu Liang.
Department of Ophthalmology,Beijing Chaoyang Hospital,Beijing 100020,China
【Abstract】 Objective Retinal ganglion cells (RGC) were retrograde labeled by injection of 3% fluorogold into both side of superior colliculus to observe the numbers and distribution of RGC .Four photographs were taken from every quadrant of the retina 2mm from the center of optic disc. Retinal ganglion cells were quantitatively analyzed by computer.Methods To identify RGC,we applied the 3%fluorogold to the superior colliculi.The retinal were examined through a fluorescence microscope after 5 days,four photographs were taken from every quadrant of the retina 2mm from the center of optic disc. Retinal ganglion cells were quantitatively analyzed by computer.Results The numbers of RGC were not significantly different between two groups. The numbers of right eye was 472.9±54.13.The numbers of left eye was 471.5±52.54.Conclusion The method that retinal ganglion cells (RGC) retrograde labeled by injection of fluorogold is reliable and effective.
【Key words】 retinal ganglion cells;fluorogold
視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGC)的慢性進(jìn)行性丟失是青光眼zui主要的病理生理學(xué)特征。高眼壓、缺血等原發(fā)性損傷首先引起一部分RGC的丟失,丟失的節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生出許多毒性物質(zhì),使其周?chē)鶵GC的生存環(huán)境惡化,細(xì)胞膜離子通透性增加,線粒體膜遭受損害,致使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序,導(dǎo)致細(xì)胞丟失[1]。因此準(zhǔn)確的RGC計(jì)數(shù)是研究青光眼發(fā)病機(jī)制及視神經(jīng)保護(hù)治療的關(guān)鍵指標(biāo)。該實(shí)驗(yàn)將熒光金(flurogold,FG)注射于SD大鼠上丘,觀察到被FG逆行標(biāo)記的RGC,以及SD大鼠RGC的數(shù)目及分布。
1 材料與方法
1.1 試劑與器械 熒光金(熒光金公司,美國(guó)),腦立體定位儀900型(David Kopf儀器公司,美國(guó)),熒光顯微鏡(AH-2,奧林巴斯公司,日本),聯(lián)想Mustek掃描儀。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠10只,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雄性,重量200~240g,裂隙燈檢查大鼠前節(jié),包括角膜、前房、虹膜和晶狀體無(wú)異常改變。Mydrine散瞳,檢眼鏡觀察眼底,包括視盤(pán)、眼底血管及部分視網(wǎng)膜無(wú)異常改變者。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在12h光照/12h黑暗的條件下飼養(yǎng)。
1.3 逆行標(biāo)記 采用雙上丘注射法逆行標(biāo)記RGC。大鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉,將其固定在腦立體定位儀上,0.5%碘伏消毒皮膚,于正中切開(kāi)皮膚向下分離達(dá)顱骨。牙科鉆鉆開(kāi)顱骨相應(yīng)部位,用微量注射器吸取3%FG(溶于0.9%生理鹽水中),每側(cè)上丘注射兩點(diǎn)(前囟后5.9 和 6.4mm,旁開(kāi)1.4mm,深4.0mm),每點(diǎn)注射1.5μl,留針5min。
1.4 視網(wǎng)膜定向鋪片 實(shí)驗(yàn)第5天,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在深麻醉下,于上方12點(diǎn)處做球結(jié)膜縫線標(biāo)記,立即取出眼球固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中2h。沿角膜緣后0.5mm剪開(kāi)眼球,去除角膜和晶狀體,分離視網(wǎng)膜并將其定向平鋪,空氣中自然干燥,市售無(wú)色指甲油封片。
1.5 熒光照片RGC計(jì)數(shù) 在熒光顯微鏡下使用V波段熒光激發(fā),距視盤(pán)中心2mm上下左右各拍攝照片1張,照片放大倍數(shù)125×,分別代表上、下、左、右四個(gè)象限的RGC數(shù)量。
1.6 圖像分析 使用聯(lián)想Mustek掃描儀將照片以100dpi掃入計(jì)算機(jī),使用彩色顆粒分析軟件(CPAS)進(jìn)行節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù),將上、下、左、右4張照片節(jié)細(xì)胞數(shù)量累加,代表該眼節(jié)細(xì)胞單位面積數(shù)量。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS for Windows 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包,采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05差異具有顯著性,P<0.01差異具有非常顯著性。
2 結(jié)果
2.1 FG標(biāo)記的RGC的形態(tài) 在FG標(biāo)記后5天,大鼠視網(wǎng)膜鋪片觀察到標(biāo)記的RGC細(xì)胞質(zhì)中熒光均勻,邊界清晰,有些細(xì)胞可見(jiàn)有熒光充盈的細(xì)胞突起,細(xì)胞外無(wú)熒光染料滲漏(見(jiàn)圖1)。
2.2 RGC計(jì)數(shù)及分布雙眼RGC單位面積數(shù)量 見(jiàn)表1。兩眼相比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。視網(wǎng)膜血管自視盤(pán)發(fā)出呈放射狀,血管走行區(qū)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞。距視盤(pán)2mm始RGC分布較致密,視網(wǎng)膜周邊部細(xì)胞分布較為稀疏(見(jiàn)圖2)。但細(xì)胞內(nèi)熒光仍較明顯。
表1 雙眼RGC單位面積數(shù)量 略
3 討論
利用軸漿流逆向輸送的特點(diǎn),在顱內(nèi)RGC投射的核團(tuán)上丘、外側(cè)膝狀體[2]、視神經(jīng)斷端近眼球一側(cè)放置辣根過(guò)氧化物酶或Diamidido Yellow,F(xiàn)G(Fluorogold),Evan Blue,Fluoro-Ruby(FR)[ 2~5]等各種熒光物質(zhì),通過(guò)逆向軸漿流將這些物質(zhì)帶到RGC胞體內(nèi),產(chǎn)生特定的染色效果,標(biāo)記出RGC,而RGC層中的其他細(xì)胞則不能著色。而HRP參與細(xì)胞代謝,不能在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存留。某些示蹤劑如快藍(lán)、核黃等,易于從標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到周?chē)M織,且照射時(shí)褪色較快,即使保存在低溫、避光條件下,仍不能長(zhǎng)期保存。另外應(yīng)用傳統(tǒng)的組織化學(xué)技術(shù)無(wú)法將RGC與視網(wǎng)膜內(nèi)其他神經(jīng)元嚴(yán)格區(qū)分,尤其是與移位的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞鑒別。利用軸漿流逆向輸送的特點(diǎn),目前多用熒光金逆行標(biāo)記上丘方法來(lái)標(biāo)記RGC,是實(shí)驗(yàn)條件下研究RGC數(shù)量動(dòng)態(tài)變化的可靠、有效方法。
熒光金在紫外線照射下,其激發(fā)光波長(zhǎng)323nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為408nm,標(biāo)記的RGC呈金黃色強(qiáng)熒光,能標(biāo)記細(xì)胞質(zhì),而細(xì)胞核不著色,能很好顯示樹(shù)突分支,細(xì)胞外無(wú)熒光染料滲漏,不易擴(kuò)散,與周?chē)M織分界清晰,除RGC層外,其余各層中均無(wú)熒光標(biāo)記的細(xì)胞。Selles-Navarro I[6]等研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用熒光金行上丘逆行標(biāo)記RGC后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光金的存在不超過(guò)3周,標(biāo)記后12天、14天、21天與標(biāo)記后37天有明顯差異。隨時(shí)間進(jìn)展熒光金可能丟失熒光或被代謝[7]。該實(shí)驗(yàn)于動(dòng)物處死前5天行熒光金逆行標(biāo)記上丘,標(biāo)記的RGC呈金黃色強(qiáng)熒光,各象限均勻。通過(guò)逆行標(biāo)記RGC可以記錄它的累積丟失,比通過(guò)凋亡標(biāo)記(如TUNEL染色)更好,通過(guò)凋亡標(biāo)記在一定的時(shí)間只能看到少量細(xì)胞[8]。此標(biāo)記方法廣泛應(yīng)用于RGC的發(fā)生和凋亡[9]、視網(wǎng)膜缺血[6]、視神經(jīng)橫斷、視神經(jīng)再生的研究。
該實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記方法為兩點(diǎn)法雙側(cè)上丘注射,因?yàn)橛?5%以上的大鼠RGC投射到上丘[10],10%左右的RGC的軸突投射到同側(cè)外側(cè)膝狀體。因此,采用對(duì)側(cè)上丘注射標(biāo)記單眼RGC的方法并不可靠,至少有10%的RGC不被標(biāo)記。上丘注射法還包括一點(diǎn)法[10]、三點(diǎn)法[11]。以往我們也采取過(guò)每側(cè)上丘注射一點(diǎn)的標(biāo)記方法,發(fā)現(xiàn)這種方法能夠成功標(biāo)記RGC的比率比較低,而且對(duì)注射精度要求高,注射點(diǎn)必須位于上丘中心(前囟后5.3mm中線外2mm,深4.5mm)。如果注射偏離上丘中心位置,將導(dǎo)致視網(wǎng)膜RGC標(biāo)記的不均勻。改用雙側(cè)上丘兩點(diǎn)注射法標(biāo)記出的RGC分布均勻,對(duì)視網(wǎng)膜各象限RGC數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異無(wú)顯著性。另外發(fā)現(xiàn)RGC數(shù)量從中心到視網(wǎng)膜周邊并沒(méi)有大幅度衰減。三點(diǎn)標(biāo)記法耗時(shí)長(zhǎng)、增加動(dòng)物感染機(jī)會(huì)、損傷較兩點(diǎn)法重。比較上丘一點(diǎn)注射法、兩點(diǎn)注射法和多點(diǎn)注射法,認(rèn)為兩點(diǎn)注射法效率高,標(biāo)記良好,有比較好的穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)證明用熒光金逆行標(biāo)記上丘方法來(lái)標(biāo)記RGC,是實(shí)驗(yàn)條件下研究RGC數(shù)量動(dòng)態(tài)變化的可靠、有效方法。
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