蛋白酶k是一種枯草蛋白酶類(lèi)的高活性蛋白酶，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到。據(jù)資料顯示：該酶有兩個(gè)ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無(wú)直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶k消化過(guò)程中通常加入edta（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對(duì)蛋白酶k具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類(lèi)，則可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l,以鰲合ca2+。

　　蛋白酶K，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性。

　　推薦反應(yīng)緩沖液：50mM Tris-HCl （pH7.5）,10mM CaCl2 。

　　蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)：20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)（proteinase K）：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

蛋白酶k的作用

　　值得注意的是，蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì),提高雜交信號(hào).但蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí),都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細(xì)胞核的消失,從而影響雜交結(jié)果.EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問(wèn)題,并能達(dá)到理想的染色效果.

蛋白酶k的保存

　　保存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。

　　孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時(shí)間為15分鐘至48小時(shí)；理想孵育時(shí)間為2小時(shí)。

編輯本段廣泛應(yīng)用

　　蛋白酶K已廣泛應(yīng)用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。皮革工業(yè)的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶，既節(jié)省時(shí)間，又改善勞動(dòng)衛(wèi)生條件。蛋白酶還可用于蠶絲脫膠、肉類(lèi)嫩化、酒類(lèi)澄清。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎，用彈性蛋白酶治療脈管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對(duì)外科化膿性創(chuàng)口的凈化及胸腔間漿膜粘連的治療。加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產(chǎn)品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血漬和蛋白污物，但使用時(shí)注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)，引起皮疹、濕疹等過(guò)敏現(xiàn)象。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
貨號(hào)： GPE-2009001
批號(hào)： 201003008
規(guī)格： 每個(gè)獨(dú)立包裝中含有100毫克的蛋白酶K凍干粉
比活性值： 40 U/mg蛋白，17.5 U/mg干粉
來(lái)源種屬： 林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）
相對(duì)分子質(zhì)量：29,730
貯存條件：
干粉狀態(tài)可在2~4ºC條件下低溫保藏。使用時(shí)，建議將每個(gè)獨(dú)立包裝的干粉全部溶解，分裝為適當(dāng)體積后，-20ºC貯存。
正確的貯存條件下，干粉狀態(tài)的有效期可達(dá)一年。液體狀態(tài)的有效期為半年。打開(kāi)包裝使用后，如果在2~8ºC環(huán)境下放置超過(guò)一周時(shí)間，建議過(guò)濾除菌后再用于實(shí)驗(yàn)。
貯存緩沖液：20 mM Tris-HCl （pH 7.4），1 mM氯化鈣，50%甘油（稀釋用緩沖液不含甘油）。
質(zhì)量控制：
活性單位定義
37ºC、pH 7.5條件下，每分鐘可水解底物酪蛋白生成1 μmol酪氨酸的蛋白酶K 的量，定義為一個(gè)單位（U）。
脫氧核糖核酸酶殘留
以λ DNA為底物，37ºC消化6小時(shí)以上，未檢測(cè)到脫氧核糖核酸酶活性。
核糖核酸酶殘留
25ºC消化16小時(shí)以上，未檢測(cè)到核糖核酸酶活性。
產(chǎn)品用途：
蛋白酶K是一種用途廣泛的非特異性的絲氨酸蛋白酶。在pH 4到pH 12的條件下均有活性，在SDS、尿素或EDTA存在時(shí)亦很穩(wěn)定。常用于提取mRNA、基因組DNA，或用于從各種細(xì)胞中提純DNA和RNA時(shí)消化雜蛋白。還可用于糖蛋白的修飾，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究等方面。

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